DNA metabolisme Winnie Eskild, IMBV 2004

DNA metabolisme DNA metabolisme omfatter: replikasjon, reparasjon og rekombinasjon DNA bærer koden/oppskriften for en organisme og må forbli korrekt DNA er det eneste makromolekyle som har sitt eget reparasjonssystem som tar seg av alle de forskjellige typer skade DNA utsettes for E. colis reparasjonsgener er godt undersøkt

E. coli DNA- reparasjonsgener

Nomenklatur Bakteriegener gis trebokstavnavn etter deres funksjon Gennavnene skrives med små skråstilte bokstaver Eksempel: dna er genet for DNA replikasjon og rev er genet for DNA rekombinasjon Flere gener for samme funksjon gis samme navn etterfulgt av en stor bokstav: dnaA, dnaB, dnaC, dnaE Bokstaven forteller oftest i hvilken rekkefølge genene ble oppdaget Når genproduktet er et protein brukes samme navn og første bokstav skrives stort: genet dnaA koder for proteinet DnaA

Replikasjon Den kopieringen av DNA som finner sted ved celledeling må være svært nøyaktig Naturen har utviklet en unik prosess med denne egenskapen Alle levende organismer kopierer sitt DNA på samme måte Systemet med at DNA er sin egen backup kopi er genialt og gjør det svært motstandsdyktig overfor skade DNA replikasjonen er semikonservativ og drar dermed full fordel av at de to DNA-trådene er komplementære Semikonservativ replikasjon betyr at de to dattercellenes DNA består av en tråd fra modercellen og en nysyntetisert tråd

Meselson-Stahl eksperimentet Bakterier ble grodd i mange generasjoner i næringsmedium med 15N i form av NH4Cl som eneste N-kilde Analyse av DNA på CsCl-gradient viste et ”tungt” bånd. Bakteriene ble overført til medium med 14N som eneste N-kilde. Vokste til bakteriene hadde delt seg én gang, dvs én replikasjon

Meselson-Stahl eksperimentet Analyse av DNA på CsCl-gradient viste et noe ”lettere” bånd. Dette er tegn på at den ene av DNA-trådene er lett og den andre tung Bakteriene fikk vokse til de hadde delt seg én gang til Analyse av DNA på CsCl-gradient viste ét bånd som på forrige gradient og ét ”lett” bånd

John Cairns eksperiment Hvordan foregår den semikonservative replikasjonen? John Cairns lot bakterier vokse i medium med 3H. Isolerte DNA og eksponerte det til røntgenfilm Resultatet viste en bobbel som ble større og større Dette viste at replikasjonen starter på ét definert sted og beveger seg i begge retninger samtidig. Begge DNA-trådene replikeres altså samtidig og de skilles først umiddelbart før replikasjonen Hver ende av replikasjonsboblen kalles en replikasjons-gaffel Det ble senere vist at replikasjonen alltid starter på samme sted, origo

Replikasjonen starter på ét definert sted og beveger seg i begge retninger samtidig

DNA DNA tråden har retning 5’-enden har fri fosfatgruppe 3’-enden har fri OH-gruppe Nukleotidenes ribosedeler er koblet sammen med fosfodiesterbindinger Basene er koplet til ribosens C-atom nr.1

DNA og hydrogenbindinger Adenin kan danne 2 hydrogenbindinger til thymin Guanin danner 3 hydrogenbindinger til cytosin Hydrogenbindingene er de eneste kreftene som holder de to DNA-trådene sammen Hydrogenbindingene er basis for komplementariteten mellom de to DNA-trådene Hvis den ene tråden har flg. sekvens: 5’-GTCATCTGAC-3’ har den andre 3’-CAGTAGACTG-5’

DNA og hydrogenbindinger De to DNA-trådene er antiparallelle: 5’ 3’ 3’ 5’ 2 hydrogen-bindinger mellom A og T 3 hydrogen-bindinger mellom C og G

DNA syntetiseres i 5’ 3’ retning DNA syntese kan bare foregå i 5’-3’ retning Templattråden avleses i 3’-5’ retning DNA-trådenes antiparallellitet medfører at den ene DNA-tråden kopieres kontinuerlig mens den andre tråden kopieres diskontinuerlig Leading strand syntetiseres kontinuerlig Lagging strand diskontinuerlig 3’ 5’ 3’ 5’ Okazaki fragment

Okazaki fragmenter I bakterier: 1000-2000 nukleotider Hos eukaryoter: 150-200 nukleotider

Polymerase reaksjonen Nukleotider selekteres ved hjelp av baseparring De koples til 3’-enden av polynukleotidet 3’-OH-gruppen retter et nukleofilt angrep mot a-fosfatgruppen i innkommende nukleotid Det dannes en fosfodiesterbinding mellom polynukleotidet og det nye nukleotidet. Pyrofosfat spaltes fra Reaksjonen drives frem av hydrolyse av pyrofosfat 2) baseparring og base ”stacking”

DNA polymerasenes egenskaper Bakterier har minst 5 forskjellige polymeraser som er spesialisert på forskjellige polymerase reaksjoner DNA polymeraser danner en fosfodiesterbinding mellom 5’-fosfo-gruppen på innkommende nukleotid og 3’-OH-gruppen på 3’-enden av eksisterende polynukleotid DNA polymeraser kan bare forlenge eksisterende polynukleotider DNA polymerasenes egenskaper: 1) polymeraser trenger en templat 2) polymerase må ha en primer 3) alle polymeraser leser korrektur i 3’-5’ retning og har 3’-5’-eksonuklease aktivitet 4) noen polymeraser har 5’-3’- eksonuklease aktivitet

E. coli polymerase I, II og III

E. coli polymerase funksjoner Polymerase I Utgjør mer enn 90% av total polymerase aktivitet Er ansvarlig for reparasjon og rekombinasjon Har 5’-3’ eksonukleaseaktivitet. Denne fjerner DNA/RNA fragmenter og setter inn nye Polymerase II Reparerer skader på DNA Polymerase III Er hovedansvarlig for replikasjonen

Eksonukleaser og endonukleaser Eksonukleaser kutter bort nukleotider fra enden av et polynukleotid, enten fra 5’-enden ( 5’-3’-ekso-nukleaser) eller fra 3-’enden (3’-5’-eksonukleaser) Endonukleaser kutter inne i polynukleotidene. Noen kutter litt vilkårlig andre kutter ved klart definerte sekvenser. En viktig gruppe er restriksjonsnukleasene 5’-3’-eksonuklease 3’-5’-eksonuklease 5’ 3’ 3’ 5’ endonuklease

Pol. I erstatter RNA-primere med DNA Primere ved start av leading strand eller Okazaki fragmenter fjernes ved hjelp av pol. I 5’-3’-eksonukleaseaktivitet. Samtidig syntetiserer pol. I et nytt fragment ut fra templat-sekvensen Et annet enzym trengs for å lage fosfodiesterbindingen mellom det nyinnsatte fragmentet og eksisterende DNA-polymer, DNA ligase

Polymerase I består av ét stort polypeptid, MW 103 kDa Pol. I kan spaltes i to fragmenter ved lett protease behandling Det minste fragmentet inneholder 5’-3’-ekso-nukleaseaktiviteten Det største fragmentet, Klenow fragmentet inne-holder de andre pol. I aktivitetene, polymerisering og 3’-5’-eksonuklease-aktiviteten Klenow er mye brukt innen bioteknologien Klenow fragmentet

Korrekturlesing Polymerase I leser korrektur på inkorporerte nukleotider og fjerner feil Pol. I har eget sete for korrekturlesing Dette sete fjerner også feil nukleotid Polymerasesetet setter deretter inn den korrekte nukleotid

Polymerase III er stort og komplekst

Polymerase III Polymerase III øker sin prosessivitet ved hjelp av b-subenheten (DnaN). Denne danner en ring som holder pol. III fast på templaten Pol. III kopler over 500.000 nukleotider før den faller av

Replikasjon krever mange enzymer I E. coli trengs over 20 forskjellige enzymer, hver med sin spesifikke oppgave Samlet kalles alle disse enzymene for et replisom eller DNA replikase system Helikaser: separerer DNA-trådene Topoisomeraser: avhjelper topologisk stress (knutedannelse) DNA-bindende proteiner: forhindrer at DNA-trådene hybridiserer dvs danner hydrogenbindinger Primaser: syntetiserer RNA-primere hvor DNA- polymerasene kan fortsette DNA polymeraser: syntetiserer DNA DNA ligaser: lukker igjen DNA tråden etter fjerning av RNA-primerne

Replikasjon består av tre faser Initiering: Origo identifiseres, DNA-trådene separeres, primer syntetiseres, Elongering: DNA-syntese av leading og lagging strand Terminering: Møte med Ter-Tus komplekset og frigjøring av de to nye kromosomene fra hverandre

E. coli replikasjon: initiering Initiering finner sted ved origo, oriC, en høyt konservert basesekvens på 245 bp To viktige sekvensmotiver: 9 baseparmotivet TTATCCACA gjentas 4 ganger i forskjellig retning 13 baseparmotivet GATCTNTTNTTT gjentas 3 ganger samme retning Minst 9 forskjellige proteiner deltar i initieringen

DnaA (ca 20 stk) binder seg til de fire 9-basepar motiver Dette fører til separering av DNA-trådene i 13-basepar motivene. Her hjelper proteinet HU og ATP leverer energien

To komplekser med hver seks molekyler DnaB (helikase) binder seg til hver av de separerte DNA-trådene. Her hjelper DnaC DnaB åpner replikasjonsboblen og etablerer en replikasjonsgaffel i hver ende ”single strand binding proteins” eller enkelttråd-bindende proteiner binder seg til DNA-trådene DNA gyrase avhjelper topologisk stress

Initiering er en regulert prosess Initiering av replikasjonen er regulert slik at den bare forekommer én gang i hver cellesyklus Det eneste trinn i replikasjonen som reguleres er initieringen Reguleringsmekanismen er ennå ikke helt klarlagt Metylering av oriC spesielt, men også resten av E.coli kromosomet inngår Kopling til cellemembranen bidrar også til regulering

Elongering av leading strand Elongering av leading strand er en kontinuerlig prosess DnaG (primase) syntetiserer en RNA-primer på 10-60 nukleotider. Den er komplementær til templaten men fjernes senere Polymerase III fester seg til templaten og kopler sammen nukleotider basert på templatsekvensen

Elongering av lagging strand Prinsipielt lik syntese av leading strand men den foregår i motsatt retning av åpningen av replikasjonsgaflen Med 1-2 X 103 basers avstand lager primo-somet en primer og pol. III syntetiserer DNA-tråden frem til forrige primer Primosomet er en egen enhet av helikase og primase innen replikasjonkomplekset Replikasjonskomplekset syntetiserer altså begge trådene samtidig Elongering av lagging strand

Replikasjonskomplekset Replikasjonskomplekset inneholder to polymerase III, en til hver av DNA-trådene Lagging strand legges i en løkke gjennom replikasjons- komplekset slik at syntesen av denne tråden holder tritt med leading strand Komplekset antas å være festet til cellemembranen og DNA føres gjennom for replikasjon Resultatet er rask koordinert syntese Ca. 1000 nukleotider per sekund koples sammen på hver tråd

Lagging-strand legges i en løkke tilbake gjennom replisomet Lagging-strand legges i en løkke tilbake gjennom replisomet. Herved kan leading og lagging-strand syntetiseres i samme retning. SSB binder til enkeltrådet DNA

Helikase tvinner opp DNA-tråden samtidig som primase syntetiserer en RNA-primer. Polymerase syntetiserer Okazaki fragmentet

Når polymerase møter forrige Okazaki fragment slipper den taket

Polymerasen leter nedover lagging-strand til neste primer og setter igang syntese av neste Okazaki fragment

Okazaki fragmentene samles DNA polymerase I bruker sin 5’-3’ eksonuklease aktivitet til å fjerne RNA-primeren Pol. I syntetiserer en DNA tråd i primerens sted Deretter lukker DNA ligase åpningen i DNA-tråden. Denne reaksjon krever ATP/NAD+

DNA ligase reaksjonen Ligasen må først aktiveres Aktivering skjer ved påkopling av AMP enten fra ATP (virus og eukaryoter) eller NAD (bakterier) AMP koples til en e-NH2-gruppe på enzymet

DNA ligase reaksjonen Ligase overfører AMP til 5’-fosfatgruppen 3’-OH-gruppen retter deretter et nukleofilt angrep mot 5’-fosfatgruppen og det dannes en fosfodiesterbinding. Energimessig fordelaktig, her spaltes en anhydridbinding og det dannes en fosfodiesterbinding

Proteinene ved replikasjonsgaflen

Terminering E. coli kromosomet er sirkulært så de to replikasjonsgaflene møtes i et termineringsområde, Ter Ter består av gjentatte 20 basers motiv Her bindes proteinet Tus (terminus utilization substance) Når den første replikasjons-gaffel treffer Ter-Tus-komplekset stopper den. Den andre stopper i møtet med den første

Terminering Etter fullført replikasjon henger det to nye kromosomene sammen, de er katenerte DNA topoisomerase IV frigjør dem fra hverandre