RT-PCR og subcellulær lokalisering

Presentasjon om: "RT-PCR og subcellulær lokalisering"— Utskrift av presentasjonen:

1 RT-PCR og subcellulær lokalisering
Bio4600

2 RT-PCR for å klone transkripter raskt
for å undersøke exon-intron-overganger for å undersøke når og hvor et gen er uttrykt isolering av mRNA 1. tråd cDNA syntese med Revers Transkriptase PCR med genspesifikke primere

3 RT-PCR – rask kloning av transkripter
isolering av mRNA revers transkripsjon innsetting i egnet vektor

4 Isolering av mRNA homogenisering av vev
binding av oligo dT til polyA haler isolering ved hjelp av magnetisk kuler oligo dT som primer for revers transkriptase

5 RT-PCR – rask kloning av transkripter
spesifikke primere egnet polymerase metode for å sette PCR-produkt inn i vektor

6 Tradisjonell kloning – bruk av restriksjonsenzymer og ligase
Vi trenger enzymer med et egnet antall gjenkjenningsseter i fragmentet vi vil klone og i vektoren tid til kutting og ligering metoder til å selektere rekombinante plasmider

7 Nye kloningsmetoder enzymatisk rekombinasjon kortere tid
mer effektiv seleksjon Topo-systemet (topoisomerase)

8 Kloning ved hjelp av topoisomerase
topoisomeraseI fra Vaccinia virus kovalent bundet til en linearisert vektor med T-overheng I 3’-enden meget rask reaksjon

9 Subcellulær lokalisering
subcellulær lokalisering forteller om proteinfunksjon metode for å se hvor proteinet er fusjonsprotein med Green Fluorescent Protein (GFP) egnete celler for å se proteinet

10 Subcellulær lokalisering
sterkt konstitutive promoter (35S) løkceller partikkel bombardement

11 Nye kloningsmetoder enzymatisk rekobinasjon kortere tid
mer effektiv seleksjon Gateway-teknologi (λ setespesifikk rekombiansjon)

12 Litt λ-biologi!

13 Litt λ-biologi DNA replication recombination head tail lysis LEFT ARM
left end right end immediate early head tail lysis pE delayed early pL pM pO OL late OR delayed early late pR pR’ Nu1 A W B C Nu3 D E FI FII Z U V G T H M L K I J att int xis exo bet gam N cI cro cII O P Q S R LEFT ARM RIGHT ARM COS COS p – promoter O - operator

14 Sete-spesifikk rekombinasjon
λ og E.coli att-seter har 15 bp felles kjerne-sekvens, men ulike flankeområder int og IHF er nødvendig for integrering int, xis og IHF er nødvendig for eksisjon

15 Gateway-kloning

16 Gateway-kloning effektiv rekombinasjon positiv og negativ seleksjon

17 Gener vi arbeider med IDA og IDA-like gener (IDL)
koder trolig for liagander antas å være eksportert ut av cellen små gener uten intron

18 Gener vi arbeider med SET-domene gener
proteiner involvert i kromatin-modulering SET-domene som modifiserer histon-haler