Fra gen til rekombinant protein

Presentasjon om: "Fra gen til rekombinant protein"— Utskrift av presentasjonen:

1 Fra gen til rekombinant protein
Bio 4600 H2003 Vigdis Lauvrak Fra gen til rekombinant protein Kloning av DNA

2 Hva trengs for å bli en mester av molekylær kloning?
Litt kunnskap om strukturen av nukleotider, DNA og gener. Litt kunnskap om innføring og replikasjon av DNA i bakterier. En del kunnskap om enzymer som bruker DNA som substrat. Kreativitet og glede

3 Dette må du vite om DNA OH 3’ 5’ T A PO4CH2 CH2O-P-O O O G C O-P-OCH2
DNA er bygd opp av nukleotider: base + sukker (deoksy ribose) +fosfat: OH 3’ C C4 C C3 C5 CH2O-P-O O A CH2 PO4 5’ C 5’ PO4CH2 O-P-OCH2 O T G C1 C2 C3 C4 C5 OH 3’

4 En DNA sekvens skrives alltid i 5’ til 3’ retning:
5’-ACGTACGT-3’ 3’-TGCATGCA-5’ En DNA sekvens skrives alltid i 5’ til 3’ retning: Den komplementære tråden foreligger i 3’ til 5’ retning Byggesteinene er: dATP, dTTP, dGTP og dCTP (dNTP) Deoksy tri-fosfat-nukleotider. Under polymerisering dannes en fosfodiester binding og to fosfat grupper spaltes av. Nukleotidne i DNA deoksy monofosfater Polymeraser setter bygger alltid på en 3’ OH ende: dvs at polymeriseringen går i 5’ til 3’ retning Spør henger dere med? Tegn på tavla!

5 Molekylærkloning er lek med DNA, nukleotider og enzymer:
Polymeraser Restriksjonsenzymer Ligase Nukleotider (dNTP) Synetiske oligonukleotider

6 DNA Polymeraser Substrat:
Templat: -DNA (Revers transkriptase: RNA (og DNA) Primer: ssDNA med 3’ hydroksyl gruppe Aktivitet: 5’ til 3’ Polymerase -(3’ til 5’ exonuclease: proof reading) - (5’ til 3’ exonuclease: nick translation) -(Rnase H aktivitet degradering av RNA fra et RNA/DNA hybrid) 5’ 3’ OH 5’

7 Ulike polymeraser har ulik aktivitet
(For detaljer se Sambrook and Russel) T4 DNA polymerase: -Primer extention. -Endemerking. -Fjerning av 3’ overheng Bacteriofag T7 polymerase: Høy grad av 3 til 5 ’ aktivitet dvs proofreading : -Sekvensering (Sequenase/Sequenase 2.0) Termostabile polymeraser: -PCR. -Primer extention Revers trankriptase: -1.tråd cDNA produksjon -5’ fill inn Terminal transferase: templat uavhengig, substrat er 3’ OH grupper -Tilføring av homopolymere haler: 2.tråd cDNA prod. -Merking av 3’ ender

8 PCR polymerase chain reaction:
Gjentatte repetisjoner av: Denaturering 94C Anealing C Polymerisering 5’ 3’ 5’ Prinsippet ble beskrevet allered i 1971 av nordmannen Kjell Kleppe, men dengang var ikke termostabile polymeraser beskrevet. Nøkkelen til suksess kom i 1985 da Amerikaneren Kary B. Mullis beskrev teknikken med bruk av termostabil DNA polymerase som tåler denatureringstrinnet. Kan dere tenke dere hvorfor Termostabile polymeraser gjorde susen- Spør Teknikken kombinert med varmeblokker med innstillbare temperatur svigninger (PCR maskiner) har revolusjonert forskning og anvendelse av molekylærbiologi. 5’ 5’

9 Hver PCR runde gir en dobling av spesifikke DNA fragmenter
. Runde 31: 2 x 10 9

10 PCR kan benyttes til å hente opp et hvilket som helst DNA fragment fra en hvilken som helst kilde.

11 Fra gen til rekombinant protein
Prokaryot: Hovedandelen av DNA er kodende sekvenser Genene inneholder ikke introner. Eukaryot: Hovedandelen av DNA er ikke-kodende Genene består av kodende eksoner og ikke-kodende introner. Genomisk kloning Krever eukaryot ekspresjon Tillater prokaryot ekspresjon Genomisk kloning cDNA kloning

12 cDNA produksjon mRNA isolering/totalRNA isolering
1.Tråd syntese: Revers transkriptase De fleste (men ikke alle)eukaryote mRNA har poly A-hale a)Bruk av oligodT primer b)Bruk av små (6baser) tilfeldige primere Dobbeltrådig cDNA produksjon Mange protokoller/mange Kits: Rnase H for fjerning av RNA PCR med spesifikke primere Terminal transferase dCTP- oligo C-hale 3’ ende Race-(Rapid amplification of cDNA ends) tilføring av en RNA oligo til mRNA før 1.tråd syntese. 5’ AAAAAAA TTTTTTT 3’ Slå opp ikatalogene og studer noen kit. Hent ned protokollene fra nettet og sjekk om dere skjønner prinsippene.

13 Vektorer er redskaper som trengs for å klone et gen og overføre dette til en organisme:
Vektorer inneholder elementer for seleksjon, replikasjon, kloning og evt ekspresjon av innsatt produkt i ønsket vertcelle. Egne forelesninger vil dekke de viktigste elementene i prokaryote og eukaryote ekspresjons vektorer.

14 Plasmid baserte kloningsvektorer (For grundig behandling av plasmider, historikk og replikasjon se Russel and Sambrook) E.coli replikasjons origo (replikon) sørger for høyt kopitall. Antibiotika resistens gen sørger for stabilt kopitall. Polylinker inneholder en rekke unike restriksjonseter gjør det mulig å sette inn DNA fragmenter vha restriksjon og ligering. Plasmider overføres til bakterier ved en prosess som kalles transformasjon Det foreligger store samlinger av genomisk DNA fra en rekke organismer i såkalte genomiske bibliotek - disse er ofte bakterievirus eller gjærbaserte vektor systemer. I tillegg til mer ller mindre tilfeldige fragmenter av genomisk DNA inneholder disse sytemene ellementer som gjør at DNAet kankan oppformeres i enten bakterier eller gjær. Kloning og modifisering av gener foregår oftest ved bruk avplasmider som kan oppamplifiseres i E.coli. Plasmider finnes i bakterier som selv replikerende enhetr som kan varierer i størrelse og kopi nummmer avhengig av spesifikke genetiske elementer. De fleste kloningsvektorer er såkalt høykopi plasmider dvs at de har et E.coli replikon som sørger for rask replikering og et høyt kopitall. Teknikken ble beskrevet i 1971 av nordmannen Kjell Kleppe. Nøkkelen til suksess kom i 1985 da Amerikaneren Kary B. Mullis beskrev teknikken med bruk av termostabil DNA polymerase som tåler denatureringstrinnet.

15 pUC vektorene ble utviklet på 80 tallet (Messing 1983, Norrander et
pUC vektorene ble utviklet på 80 tallet (Messing 1983, Norrander et.al 1983, Vieira and Messing 1987) og er fremdeles i bruk som kloningsredskaper. pUC vektorer var de første vektorene som hadde såkalte multiple cloning sites eller polylinkere. pUC replikonet er et modifisert pMB1 replikon som gir mellom 500 og 700 kopier. De aller fleste andre kloningsvektorer er bygget over samme lest som pUC. (Legg merke til at pUC vektorer ikke har noen ekspresjons elementer og proteiner kan ikke uttrykkes fra disse).

16 Restriksjonsenzymer:
Første gang beskrevet i Starten på den molekylærbiologiske revolusjon. Restriksjonsenzymer produseres av bakterier som forsvar mot fremmed DNA. Kommersielle restriksjonsenzymer er som regel rekombinant produsert i E.coli. Navn etter opphav: Eco: Escherichia.coli Sau: Staphylococcus aureus Bam: bacillus amyloliquefaciens Bakteriene beskytter eget DNA med metylering på spesifikke adenosin og cytosin eneheter. Noen restriskjonenzymer gjenkjenner umetylerte DNA sekvenser, mens andre gjenkjenner metylerte DNA sekvenser. Endonuklease aktivitet: En fosfodiester binding brytes og endene får hhv en 5’ (mono) fosfat-gruppe og en 3’ hydroksyl gruppe. Alltid: Spesifikk gjenkjenningsekvens. Vanlig: Kutting i gjenkjenninsekvensen. Vanlig: Palindrom gjenkjenningsekvens på 4 eller 6 baser: 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’

17 Blunt end: ingen overheng GAAOH PTTC
CTTP OHAAG Staggered: - 5’ overheng GOH PAATTC CTTAAP OHG - 3’ overheng GAATTOH PC CP OHTTAAG Overheng vil hybridisere base spesifikt T4 ligase ligerer 3’OH og 5’P Kutting med 2 ulike enzym gir mulighet for retningsbestemt kloning.

18 Restriksjonsetet kan ligge utenfor gjenkjenningsekvensen:
Restriksjonsetet utgjør ikke nødvendigvis en del av gjenkjenningskevensen Sfi GGCCNNNNNGGCC Dette gir mulighet for retningsbestemt kloning ved bruk av bare ett enzym (se foredrag Phage display Vigdis Lauvrak). Restriksjonsetet kan ligge utenfor gjenkjenningsekvensen: Eam1104 I CTCTTCNNNNNN Dette kan gi mulighet for retningsbestemt kloning av ett PCR amplifisert innskudd inn i en PCR amplifisert vektor uten at ligerings produktet har kutteseter ( se Seamless® Cloning Kit at

19 Ligering: Sammenspleising av DNA fragmenter
T4 DNA Ligase Aktivitet: Dannelse av en fosfodiester binding mellom nærliggende 3’hydroksyl ender og 5’fosfat ender. Unit def: 1 weiss Unit = mengde enzym som katalyserer utskifte av 1 nmol 32P fra gb32ATP ved 20min ved 37 C. 1 Weiss U = 60 cohesive end U. Sammenspleising av ender med kompatible overheng. Sammenspleising av ender uten overheng Dobbeltrådige ender som mangler 5’ fosfat på enten vektor eller innskudd kan ligeres sammen. Det vil foreligge et Nick-men dette vil repareres i vertcellen. Fosfatase behandling av vektor eller innkudd hindrer selv-ligering av palindrome sekvenser eller blunt ends. Tegn endel på tavla Vis eksempel på ligering av ender med komtabible palindrome overheng og ender uten palindrome overheng.

20 Noen andre artige enzymer du kan få bruk for:
T4 DNA polynukleotid Kinase: -Merking av 5’ ender, Fosforylering av syntetiske oligonukleotider (Syntetiske oligonukleotider mangler 5’ fosfat ende (kan bestilles) og kan ikke ligeres) Termostabile ligaser: Ligase amplifisering-mutasjonsdeteksjon T4 RNA ligase: ligering av RNA eller enkeltrådig DNA Alkalisk Fosfatase: Fjerning av 5’ fofat gruppe før merking med 32P eller før ligering for å unngå selv ligering. Nukleaser