Genteknologi Kapittel 19 Copyright © McGraw-Hill Companies Permission required for reproduction or display Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Restriksjon Endonukleaser Genetisk Ingeniørkunst Eksperimenter Oversikt Restriksjon Endonukleaser Genetisk Ingeniørkunst Eksperimenter DNA Sekvens Teknologi Biochip Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Interferon Hvordan interferon beskytter kroppen mot virus-infeksjoner: Når virus infekterer cella spøyter den inn sitt arvemateriale som blir kopiert sammen med cellas arvematerial og nye virus blir dannet. Interferon blir dannet av cella før den dør. Andre celler tar opp interferon podusert av den døde cella . Disse blir stimulert til å slå på gener som koder for antivirale proteiner. Antivirale proteiner vil blokkere neste forsøk på virusinfeksjon. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Markerer starten på genetisk ingeniørkunst (genetic engineering): I 1980 spleiset genetikere det humane genet som koder for interferon inn i en bakterie-celles genom. Markerer starten på genetisk ingeniørkunst (genetic engineering): evne til å kutte opp DNA-et i biter som kan kjennes igjen og settes sammen på forskjellige måter Kloning: produksjon av en linje av genetisk identiske celler fra 1 enkelt endret celle I 1980 spleiset genetikere det humane genet som koder for interferon inn i en bakterie-celles genom. Interferon er et sjeldent blodprotein som øker menneskets motstandsdyktighet mot virale sykdommer, og en mulig behandling av kreft, HIV og hepatitt C. Veldig lite blir produsert naturlig. Markerer starten på genetisk ingeniørkunst (genetic engineering):evne til å kutte opp DNA-et i biter som kan kjennes igjen og settes sammen på forskjellige måter Årsaken til at det er så lurt å putte genet inn i en bakteriecelles genom er at bakterieceller deler seg veldig fort (E.coli hver 20 min) og med riktig promoter foran interferon-genet blir hver bakteriecelle en minifabrikk, produserer masse interferon ut i mediumet. En bakteriecelle som har fått satt inn interferongenet deler seg som igjen deler seg osv. Alle disse har det samme genomiske materiale - de er del av en klon. Prosessen kalles kloning. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Restriksjons Endonukleaser (restriksjonsenzym, RE) Gjennom naturlig seleksjon inneholder noen bakterier enzymer, restriksjons endonukleaser, RE, som fragmenterer viralt DNA. Gjenkjenner spesifikke nukleotid sekvenser, og kløyver DNA-et. Metylerer eget DNA. Restriksjons endonukleaser eller restriksjonsenzym som jeg vil kalle de heretter, er bakterieres forsvar mot virusinfeksjoner. Dette er enzym som gjenkjenner spesifikker sekvenser i DNA og kløyver DNA-et i to på disse setene. De virker som sakser. For at enzymene ikke skal kutte bakteriens eget DNA i to på disse setene metylere bakterien sitt eget DNA, slik at RE ikke får tilgang til sitt eget DNA. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

RE kan bindes til og kløyver begge DNA-trådene. Sekvenser gjenkjent av RE er typisk fire til seks nukleotider lange, og er ofte palindromer. RE kan bindes til og kløyver begge DNA-trådene. Kuttede seter på de to trådene i en duplex er forskjøvet i forhold til hverandre. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

A MAN, A PLAN, A CANAL -- PANAMA! Palindromer REGNINGER RADAR ABBA AGNES I SENGA SUP SUR BRUS, PUS! A TOYOTA OLSON IS IN OSLO AND E.T. SAW WASTE DNA A MAN, A PLAN, A CANAL -- PANAMA! Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Samme sekvensen på den andre DNA-tråden enzymet kutter også der. Vi kjøper restristriksjonsenzymene kommersielt, det finnes firma som produserer disse og selger. Her er en side fra en katalog fra et firma New England Biolabs i USA med beskrivelser av restriksjonsenzymet EcoRI. Navnet sitt har det har det fått fra den bakteriestammen det først ble isolert fra E.coli Restriksjons enzym 1. Her ser dere gjenkjenningssekvensen til EcoRI - GAATTC og hvor det kutter i sekvensen. Samme sekvensen på den andre DNA-tråden enzymet kutter også der. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

En RE kan kutte DNA fra enhver kilde til fragmenter. Det finnes hundrevis av bakterielle RE, hver med sin spesifikke gjenkjennings-sekvens. En RE kan kutte DNA fra enhver kilde til fragmenter. På grunn av komplementaritet, kan enkeltrådete ender pare med hverandre. Klebrige Ender (”Sticky Ends”) Fragmenter limes sammen med DNA ligase. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Restriction sites GAATTC DNA duplex CTTAAG Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Restriction endonuclease cleaves the DNA. Sticky ends (complementary single-stranded DNA tails) G CTTAA AATTC Restriction sites CTTAAG GAATTC DNA duplex Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

DNA from another source cut with the AATTC G CTTAA DNA from another source cut with the same restriction endonuclease is added. Restriction endonuclease cleaves the DNA. Sticky ends (complementary single-stranded DNA tails) Restriction sites CTTAAG GAATTC DNA duplex Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Recombinant DNA molecule G AATTC CTTAA G DNA ligase joins the strands. DNA from another source cut with the same restriction endonuclease is added. Restriction endonuclease cleaves the DNA. Sticky ends (complementary single-stranded DNA tails) Restriction sites CTTAAG GAATTC DNA duplex Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Bruk av RE for å Manipulere Gener Chimera (”fantasifoster”) En av de første rekombinante genomer produsert ved genetisk ingeniørkunst var et bakterielt plasmid hvor et amfibie ribosomalt RNA-gen ble satt inn i. Virus kan også bli brukt som vektorer for å sette inn fremmendt DNA inn i vertscellene. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Genoverføring mellom bakterier Copyright © McGraw-Hill Companies Permission required for reproduction or display Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Eksempel på genmanipulering Vidunder-oksen Herman Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Genetisk Ingeniørkunst Eksperimenter Fire trinn: 1: DNA Kløyving RE kløyver kilde-DNA til fragmenter. 2: Produksjon av Rekombinant DNA DNA fragmenter settes inn i plasmider eller virale vektorer. 3: Kloning Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

En agarosegel Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

DNA-analyse fra gel elektroforese Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Genetisk Ingeniørkunst Eksperimenter 4: Screening Kloner med DNA-fragment av interesse blir identifisert fra klonbiblioteket. 4-I: Foreløpig Screening - Fjerne kloner uten vektor and kloner med vektorer som ikke inneholder DNA-et av interesse. Anvender vektor med gen for antibiotika-resistens og lac Z’ genet. Dyrker i vekstmedium med amp og X-gal. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Genetisk Ingeniørkunst Eksperimenter 4-II: Sekundær Screening (Genet av Interesse) Hybridisering - klonede gener danner basepar med komplementære sekvenser på en annen nukleinsyre (probe). Dyrke opp på agar and så overføre til et filter presset mot koloniene. Behandle filteret med en radioaktiv probe, og utfør autoradiografi. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Polymerase Chain Reaction (Polymerase Kjede Reaksjon), PCR Å jobbe med Gen Kloner Polymerase Chain Reaction (Polymerase Kjede Reaksjon), PCR Brukt til å kopiere spesifikke gen-sekvenser. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

PCR Tre Basis Trinn: Denaturering (Dobbeltrådet Enkeltrådet DNA) Hybridisering av Primere (Primere festes til Enkeltrådet DNA) Primer forlenging (DNA polymerasen lager ny DNA tråd komplementær til Enkeltrådet DNA) DNA polymerasen man først begynte å jobbe med var en fra Thermus Aqaticus bakterien Taq varmestabil DNA polymerase siden bakterien naturlig lever i ganske varme forhold. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

PCR - DNA kopieringsmaskin Man kan se på PCR maskina som en kopieringsmaskin som kopierer millioner av DNA molekyler pr time. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Identifisere DNA: Southern Blotting Å jobbe med Gen Kloner Identifisere DNA: Southern Blotting Prøve-DNA blir kløyvd til restriksjons- fragmenter, og spredd fra hverandre ved gel elektroforese. Gel blir blottet over på et nitrocellulose-ark. En probe med renset, enkel-trådet DNA blir helt over arket. Hvis en radioaktiv probe blir brukt, vil et radioaktivt bånd dukke opp der hvor proben har hybridisert med et komplementært fragment. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Å jobbe med Gen Kloner Restriksjons Fragment Lengde Polymorfismer (RFLP-er) kan bli brukt til å identifisere et spesielt individ. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Å jobbe med Gen Kloner Komplementært DNA (cDNA) er et dobbel-trådet DNA molekyl som inneholder et gen uten intron. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

DNA Fingerprinting (Fingeravtrykk) Å jobbe med Gen Kloner DNA Fingerprinting (Fingeravtrykk) Fordi to individer sjelden produserer identiske RFLP analyser, kan DNA fingeravtrykk bli brukt i kriminal etterforsking. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

DNA profiler brukt som bevis i rettssak Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

DNA Sekvens Teknologi Genom Sekvensering Takket være teknologiske framskritt, er nå sekvensering av hele genom praktisk gjennomførbart. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Human Genome Project (HUGO) DNA Sekvens Teknologi Human Genome Project (HUGO) Genomet i mennesket inneholder rundt 3,2 milliarder baser og rundt 30 000 gener. Humane gener er ganske fragmenterte. En tredjedel av genomet består av ikke-kodende repeterte sekvenser. Gener er ikke jevnt fordelt utover genomet. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Genomet i mennesket Ikke så stor forskjell i antall gener som man skulle tro Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Katalogisering og analyse av hvert protein i menneskekroppen. DNA Sekvens Teknologi Proteonomics Katalogisering og analyse av hvert protein i menneskekroppen. Hvert gens nukleotid-sekvens spesifiserer en aminosyre-sekvens foldet på en spesiell måte. Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Skanning stråle brukt til å bygge nukleotider. Biochip Gen Microarray (Biochip) er små plater av glass dekket med millioner av tråder av DNA. Skanning stråle brukt til å bygge nukleotider. Ser på Single Nucleotide Polymorphisms (SNP-er). Kreft Screening Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Raven - Johnson - Biology: 6th Ed Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

Restriksjon Endonukleaser bakteriers forsvar mot virus Oversikt Restriksjon Endonukleaser bakteriers forsvar mot virus 4-6 nt lang gjenkjenningssekvens kløyver begge trådene lager ”sticky ends” Genetisk Ingeniørkunst Eksperimenter DNA kløyving Produksjon av rekombinant DNA Kloning Screening Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies

DNA Sekvens Teknologi Proteomics Biochip Raven - Johnson - Biology: 6th Ed. - All Rights Reserved - McGraw Hill Companies