Nukleinsyrer og proteinsyntese Pensum: Solomon&Fryhle kap Nukleinsyrer og proteinsyntese Pensum: Solomon&Fryhle kap. 25 Pensum: Hele kapitlet

Introduksjon Deoksyribonukleinsyre (DNA) og ribonukleinsyre (RNA) er molekylene som bærer den genetiske informasjonen i cellene DNA er det molekylære arkivet for proteinsyntese RNA molekyler transkriberer og oversetter informasjonen fra DNA så den kan bli brukt for å styre proteinsyntese DNA er sammensatt av to polymer-kjeder som holdes sammen av hydrogenbindinger Dets overordnede struktur er som en vridd stige Sidene av stigen er alternerende sukker og fosfatgrupper Trinnene i stigen er hydrogenbundede par av heterosykliske aminbaser Chapter 25

DNA polymere er svært lange molekyler DNA er krøllet og pakket inn i 23 kromosomer som igjen er pakket inn i cellekjernen Rekkefølgen av de heterosykliske aminbasene i DNA koder for den genetiske informasjonen som er nødvendig for å syntetisere proteiner Bare 4 forskjellige baser blir brukt for å kode i DNA En del av DNA som koder for et spesifikt protein kalles et gen Settet av all genetisk informasjon som kodes av DNA kalles organismens genom Settet av alle proteiner som blir kodet for i genomet i en organisme og som uttrykkes til en gitt tid er et proteom Rekkefølgen av det humane genomet gir verdifull informasjon om organismens helse Eksempel: Et skjematisk kart av gener på kromosom 19 som er knyttet til sykdom Chapter 25

Nukleotider og nukleosider Mild degradering av nukleinsyrer gir monomere enheter kalt nukleotider Videre hydrolyse av nukleotider gir: En heterosyklisk amin base D-ribose (fra RNA) eller 2-deoksyy-D-ribose (fra DNA); begge er C5 monosakkarider Et fosfat jon Den heterosyliske basen er bundet av en b N-glykosidisk binding til C1’ av monosakkaridet Eksempler: En generell struktur av et RNA nukleotid (a) og adenylsyre (b) Et nukleosid er et nukleotid uten fosfatgruppen ET nukleosid av DNA inneholder 2-deoxy-D-ribose og en av de følgende 4 baser Chapter 25

Et nukleosid av RNA inneholder sukkerenheten D-ribose og en av de fire basene adenin, guanin, cytosin eller uracil Chapter 25

Nukleosider som finnes i DNA Chapter 25

Nukleosider som finnes i RNA Chapter 25

Nukleotider kan navngis på mange måter Adenylsyre kalles vanligvis AMP (adenosin monofosfat) Den kan også kalles adenosin 5’-monofosfat eller 5’-adenylsyre Adenosin trifosfat (ATP) er et viktig molekyl som energireservoar Molekylet 3’,5’-syklisk adenylsyre (syklisk AMP) er en viktig regulator av hormonaktivitet Dette molekylet biosyntetiseres fra ATP av enzymet adenylat syklase Chapter 25

Laboratoriesyntese av nukleosider og nukleotider Silyl-Hilbert-Johnson nukleosidering En N-bensoyl-beskyttet base reagerer med et bensoyl-beskyttet sukker i nærvær av tinnklorid og BSA (et trimethylsilylerings-reagens) Trimethylsilyl-beskyttelsesgrupper blir fjernet med vandig syre i det andre trinnet Bensoyl-gruppene kan fjernes med base Chapter 25

Unaturlige nukleotid-derivater kan syntetiseres fra nukleosider som har en substituerbar gruppe på den heterosykliske ringen Chapter 25

Dibensyl fosfokloridat er et fosforyleringsreagens for omdannelse av nukleosider til nukleotider 5’-OH blir fosforylert selektivt hvis 2’- and 3’-OH gruppene er beskyttet Chapter 25

Deoksyribonukleinsyre: DNA Primær struktur Monomer-enhetene, nukleinsyrene er nukleotider Nukleotidene er bundet sammen med fosfatester bindinger Ryggraden i nukleinsyrer består av alternerende fosfat- og sukkergrupper Heterosykliske baser er bundet til ryggraden på hver sukkerenhet Rekkefølgen av baser utgjør koden I den genetiske informasjonen Rekkefølgen av baser blir alltid spesifisert fra 5’ enden av nukleinsyren Chapter 25

Sekundær struktur Sekundærstrukturen av DNA ble foreslått av Watson and Crick i 1953 E. Chargaff bemerket at i DNA var prosentandelen av pyrimidin baser tilnærmet lik prosentandelen av purin baser Molprosenten av adenin er nesten lik den for tymin Molprosenten av guanin er nesten lik den for cytosin Chargaff observerte også at forholdet mellom A and T versus G og C varierte mellom artene men forholdet er det samme for forskjellig vev i den samme organismen Chapter 25

Røntgen krystallografiske data viste bindingslengder og vinkler for purin og pyrimidin baser Røntgen data viste også at DNA hadde en lang repetisjons-avstand (34 Å) Basert på disse data, foreslo Watson og Crick den doble heliks modellen for DNA (neste side) To nukleinsyre-kjeder holdes sammen ved hydrogenbindinger mellom basene i motstående kjede Dobbel-kjeden er tvunnet som en heliks Hver sving i heliksen er 34Å lang og involverer 10 suksessive nukleotid-par Hvert basepar må involvere en purin og en pyrimidin for å oppnå riktig avstand mellom sukker-fosfat ryggraden Base-paring kan forekomme bare mellom tymin og adenin, eller cytosin og guanin; T – A og C – G ingen andre paringer har det optimale mønster av hydrogenbinding eller ville tillate at avstanden mellom sukker-fosfat ryggraden å bli regelmessig Chapter 25

Chapter 25

Spesifikk paring av baser betyr at de to kjeder av DNA er komplementære Hvis man kjenner rekkefølgen av en kjede, kjenner man også rekkefølgen av den andre kjeden Chapter 25

Replikasjon av DNA (se neste side) DNA kjeden begynner å folde seg ut like før celledeling Komplementære kjeder dannes langs hver kjede (vi sier at hver kjede fungerer som et templat for en ny kjede) To nye DNA molekyler er resultatet; en kjede går til hver datter-celle Chapter 25

Chapter 25

RNA og proteinsyntese “The central dogma of molecular genetics” Et gen er den del av et DNA molekyl som koder for ett protein Proteiner har mange kritiske funksjoner, f.eks. katalyse, struktur, bevegelse, celle- signalering, immunrespons osv. DNA befinner seg i cellekjernen og proteinsyntese skjer i cytoplasma Transkripsjon av DNA til messenger RNA (mRNA) skjer i kjernen mRNA diffunderer til cytoplasma og det skjer en translasjon til proteiner ved hjelp av to andre former for RNA: ribosomalt RNA (rRNA) og transfer RNA (tRNA) Chapter 25

Transkripsjon: Syntese av Messenger RNA (mRNA) I kjernen blir et DNA molekyl delvis “pakket ut” for å eksponere en del korresponderende til minst ett gen Ribonukleotider med komplementære baser samler seg langs DNA enkeltkjeden Base-paring er den samme i RNA, bortsett fra at i RNA tymin erstattet av uracil Ribonukleotider blir koblet til en kjede av mRNA av enzymet RNA polymerase Chapter 25

Hvert gen inneholder vanligvis mange introner og exoner Et intron (intervening sequence) er et segment av DNA som blir transkribert til mRNA men blir ikke brukt til noe når et protein blir uttrykt Et exon (expressed sequence) er et segment i DNA genet som blir uttrykt Hvert gen inneholder vanligvis mange introner og exoner Introner blir utskilt fra mRNA etter transkripsjon Chapter 25

Se figur 25.14, side 1238 (Den mekanismen skal ikke pugges) Ribosomer - rRNA Protein syntese blir katalysert i cytoplasma av ribosomer Et ribosom består av tilnærmet 2/3 av RNA og 1/3 protein Et ribosom er et ribozym (en reaksjons-katalysator, eller enzym som består av ribonukleinsyre) Et ribosom har 2 store under-enheter 30S under-enheten binder mRNA som koder for proteinet som skal oversettes 50S under-enheten katalyserer dannelse av amidbindingen i proteinsyntesen Overføring av en aminosyre til den voksende peptidkjeden blir hjulpet av syre-base katalyse som involverer et adenin i 50S under-enheten Se figur 25.14, side 1238 (Den mekanismen skal ikke pugges) Chapter 25

Transfer RNA (tRNA) Transfer RNA (tRNA), som er spesifikk for hver aminosyre, transporterer aminosyrer til komplementære bindingssteder på mRNA som er bundet til ribosomet Mer enn ett tRNA koder for hver aminosyre tRNA er sammensatt av et relativt lite antall nukleotider hvis kjede er foldet til en struktur med flere looper En arm av tRNA avslutter alltid i sekvensen cytosin-cytosin-adenin, og det er her aminsyren blir tilknyttet PÅ en annen arm blir en rekke av tre baser kalt anticodon, som binder seg til det komplementære codon på mRNA Den genetiske koden for mRNA er vist på neste side Strukturen på et tRNA molekyl er vist i fig. 25.15, på side 1240 Chapter 25

Transfer RNA (tRNA) Chapter 25

Chapter 25

Den genetiske kode Den genetiske kode er basert på tre-base rekkefølger i mRNA Hver tre-base rekkefølge korresponderer til en spesiell aminosyre Det faktum at tre baser brukes for å kode for hver aminosyre gir unikhet i den overordnede koden og i start og stoppsignaler N-formyl metionin (fMet) er den første aminosyren som bygges inn i bakterielt protein og synes å være start signalet fMet blir fjernet fra proteinkjeden før dets syntese er fullført Chapter 25

Oversettelse (translation) Oversettelse er rett og slett peptidsyntese ved hjelp av et ribosom ved å bruke en kode fra et mRNA Følgende trinn er et eksempel (se figur på neste side): Et mRNA binder seg til et ribosom Et tRNA med anticodonet for fMet binder seg til fMet codonet på mRNA Et tRNA med anticodon UUU bringer et lysin residu til AAA mRNA codonet 50S ribosomet katalyserer dannelse av amidbinding mellom fMET og lysin Ribosomet beveger seg nedover mRNA-kjeden til det neste codonet (GUA) Et tRNA med anticodon CAU bringer et valin residu Ribosomet katalyserer amidbinding mellom lysin og valin Ribosomet beveger seg nedover langs mRNA-kjeden og prosessen fortsetter, f.eks. med tRNA for fenylalanin-binding til ribosomet Et stoppsignal nåes og ribosomet separeres fra mRNA På dette tidspunktet separeres også polypeptidet også fra ribosomet Polypeptidet begynner å innta sin sekundære og primære struktur mens det blir syntetisert Mange ribosomer kan oversette det samme mRNA molekylet samtidig Proteinmolekylet syntetiseres bare når det er behov for det Regulatormolekyler bestemmer når og hvis et spesielt protein blir uttrykt, dvs. syntetisert Chapter 25

Chapter 25

Bestemmelse av baserekkefølgen i DNA Kjede-termineringsmetoden (Dideoksynukleotide) DNA molekyler blir kopiert på en slik måte at en serie av delvise kopier blir generert; hver DNA-kopi er forskjellige i lengde bare med en base Tilfeldig kjede-terminering blir gjort ved å “forgifte” en kopieringsreaksjon med en lav konsentrasjon av 2’3’-dideoxynucleotides – (mangler den 3’-OH-gruppen som normalt danner binding til neste nukleotid) Kjede forlengelse blir umulig ved deres 3’posisjon 2’3’-dideoksynucleotidenemerkes med kovalent tilknyttet fluorescens fargestoffer, med hver farge representer sin basetype De delvise kopiene blir så separert i henhold til lengde på kjeden ved kapillær-elektroforese Den terminale basen på hver DNA enkeltkjede blir så detektert ved sin spesifikke farge ved laser-indusert fluorescens når hver enkelt DNA passerer detektoren Et 4-fargers kromatogram blir generert (se figur 25.17, side 1246) Chapter 25

Automatisering av “high-throughput ‘dideoxy’” sekvensbestemmelse muliggjorde fullføringen av Det Humane Genom Prosjektet ved 50-års feiringen av Watson og Crick’s utledning av strukturen til DNA i 2003 Chapter 25

Laboratoriesyntese av DNA Fastfase metoder for laboratoriesyntese av DNA likner på de som brukes for laboratoriesyntese av proteiner Fastfasen er ofte glass med kontrollert porestørrelse (CPG) Beskyttelse/blokkeringsreagenser er nødvendig (f.eks. dimetoksytrityl og b-cyanoetyl grupper) Et koblingsreagens (1,2,3,4-tetrazol) brukes for å knytte sammen de beskyttede nukleotider Chapter 25

Chapter 25

Polymerase kjedereaksjon (PCR) PCR er en ekstremt enkel og effektiv metode for å eksponentielt multiplisere (forsterke) antall kopier av et DNA molekyl. PCR kan begynne med et molekyl og gi 100 milliarder kopier på en kveld Nobelprisen ble gitt til K. Mullis i 1993 for PCR oppfinnelsen PCR trenger: En prøve av det DNA som skal kopieres Enzymet DNA polymerase En kort ‘primer’ kjede komplementær til templat DNAet Et forråd av A, C, G, og T nukleotid trifosfat monomere Et enkelt apparat for termisk kontroll under reaksjons sekvensen PCR prosessen kan oppsummeres som vist på de neste 2 sidene Chapter 25

Chapter 25

Chapter 25