Påvisning av antistoff, identifisering og forlik Magne Børset - Avd. for immunologi og transfusjonsmedisin, St.Olavs hospital Institutt for kreftforskning og molekylær medisin, NTNU

Hvorfor påvise og identifisere irregulære blodtypeantistoff ? Hos pasienter: For å gi RBC uten det antigenet som antistoffet er retta mot unngå transfusjonsreaksjoner Hos gravide: oppdage og behandle hemolytisk sykdom hos fosteret

”Veilederen” sier om antistoffpåvisning: ”Før transfusjon må det undersøkes om pasienten har irregulære blodtypeantistoffer som kan destruere de transfunderte erytrocyttene.” Dette gjøres ved antistoffscreening og eventuell identifisering. (Ikke tilstrekkelig med enkelt og utvida forlik. Unntak: hastesituasjoner)

Før blodtransfusjon Transfusjonslab Blodbank ABO- & Rh-typing (minst x 2) Antistoffscreening (høyst 4 dager siden sist) Pasient Giver Giver Giver types og det sjekkes om typingen er identisk med opprinnelig typing. Etter motatt transfusjon og svangerskap skal giver screenes på nytt for antistoff. Ny ABO- & Rh-typing Forlik: Donor-RBC + pasientserum (ev. dataforlik)

Antistoffscreening Oftest tre celler med kjent fenotype Dekker alle klinisk viktige antigener IAT-teknikk Automatisert ”type and screen”

”Veilederen” sier om antistoffscreening: Screeningcellene må dekke alle klinisk viktige antigener Rh(C,D,E,c,e), Fy(a,b), Jk(a,b), MNSs-antigenene bør være homozygot forekommende på minst en av cellene. Det må brukes lavione (LISS) indirekte antiglobulinteknikk.

Hvem screenes? Pasienter ved innleggelse i sykehus: Øyeblikkelig hjelp Elektiv operasjon med blødningsrisiko Forventet eller fryktet blødning Gravide: Ved tidlig svangerskapskontroll (10 – 13 uker) Rh-neg gravide også ved 32 og 36 uker Blodgivere: Ved første gangs giving Etter graviditet og/eller etter blodtransfusjon

Indirekte antiglobulintest (IAT) glassteknikk Negativ: Ikke antistoff i serum Pasient- serum Tilsett antiglobulin Inkuber ved 37oC vask x 3 spinn Positiv: Antistoff i serum Screening-RBC

Glassteknikk Vanskelig å tolke svake reaksjoner. Graden av risting kan påvirke testresultatet.

IAT - gelteknikk Positiv antistoffscreening.

Prinsippet ved gelteknikk Gelmatriksen (glasskuler/sephadex/polyacrylamid) virker som et såld Store agglutinater fanges på toppen Små agglutinater passerer delvis gjennom gelen avhengig av størrelse Ikke-agglutinerte celler i bunnen

Gelteknikk Brukes ved de fleste immunhematologiske rutineprøvene Blodtyping Antistoffdeteksjon Forlik To slags geler Reaktiv, d.v.s. tilsatt reagens, f. eks blodtypeantistoff el. anti-human-globulin Nøytral

Mindre uspesifikke reaksjoner med anti-IgG Mindre uspesifikke reaksjoner med anti-IgG. Skal brukes hvis tilsatt PEG.

Gradering av reaksjoner i gelkort - ++++

Gradering av reaksjoner i gelkort Kan avleses manuelt eller maskinelt

Gradering av reaksjoner i gelkort

Positiv screening sier at antistoff er tilstede, men… vi vet ikke hva antistoffet er rettet mot Må sette opp identifikasjonprøve Bruker et PANEL av røde testceller (ofte 11) med kjent fenotype (O-celler) Tester pasientens serum mot disse cellene

Lokalt skjema i Trondheim

Lokalt skjema i Trondheim Viktig informasjon: Blodtype/fenotype: Sier noe om mulig antistoffspesifisitet Gravid? Risiko for HDN? Krever eget kontrollregime Hvis påvist anti-D, fått profylakse? Tidligere transfundert? Naturlig forekommende antistoff eller resultat av immunisering? Ble pas. transfundert med mistenkt antigen? Hvis transfundert siste tre måneder: fenotyping kan være upålitelig og reaksjon mot egne celler kan skyldes alloantistoff Blodgiver? Må avregistreres?

Lokalt skjema i Trondheim Viktig informajon: Resultat av screening: IAT, ev. også med enzym eller ved 4 grader Positiv DAT? Ofte autoantistoff av varmetype hvis bare IgG+ Ofte autoantistoff av kuldetype hvis bare C3d+ Positiv hos nyfødte med risiko for HDN? Mixed field: Transfusjonsreaksjon? Identifisering, ulike teknikker IAT 37 grader IAT mot enzymbehandla celler Saltvannsteknikk: ved 4 grader uten AHG Titrering av antistoff Farlige antistoff hos gravide Parallelltitrering mot tidligere prøve fra samme pasient

Identifisering Mønster i reaksjonene avslører identiteten A -

Enzymbehandla panelceller Antigener som forsterkes etter enzymbehandling er markert med fiolett, mens antigener som svekkes er markert med blått

Mulige problemer: Falskt negative prøver Falskt positive Klinisk viktige antistoff som svekkes over tid, men kan reaktivers Anti-Kidd  Viktig med høy sensitivitet (homozygote celler) Alloantistoff adsorbert til blod som pas. har fått transfundert Falskt positive Pengerulldannelse (Rouleaux) (Mindre problem i gelteknikk) Gammaglobulinemi Pas har fått volumekspander Fibrinkoagel Multiple antistoff Vanskelig å tolke reaksjonmønster Reaksjon med alle cellene i panelet Ev. også mot pasientens egne celler Fibrin gir gjerne mixed field-liknende bilde. Hvis fibrin, spinn prøven og prøv på nytt.

Er alle positive reaksjoner like sterke? Multiple antistoff? Er alle positive reaksjoner like sterke? Indikerer at reaksjonene skyldes ett antistoff (obs. svakere reaksjon mot heterozygote celler).

Ulike metoder gir forskjellig reaksjonsmønster Multiple antistoff? Ulike metoder gir forskjellig reaksjonsmønster Indikerer flere enn ett antistoff.

Hvordan identifisere multiple antistoff? Sette opp panelet ved ulike betingelser IAT Velegna for IgG-antistoff Saltvann Velegna for IgM-antistoff Enzymbehandla celler Øker sensitiviteten for noen antistoff, svekker den for andre Sette opp flere paneler (nye celler) Hvis mistanke til et antigen, test mot celler som er negative for dette antigeneet Sende til spesiallaboratorium Nærmeste universitetssykehus - Ullevål - Bristol

Pengerulldannelse (Rouleaux) Svake reaksjoner mot mange/alle celler i panelet, men ikke mot autoceller, kan skyldes… Pengerulldannelse (Rouleaux) Gammaglobulinemi Pas har fått volumekspander Høytiter-lavaviditets-antistoff (HTLA) Gjør titrering Antistoff mot høyprevalensantigen F.eks. anti-Jsb, -k, -Lub Anti-HI: test prøven mot A1-celler anti-Jsb, -k (Chellano), -Lub

Høytiter-lavavidites-antistoff (HTLA): svake reaksjoner mot alle cellene - vedvarer gjennom mange fortynninger (titer minst 1 : 64)

Antistoff mot høyprevalensantigen Anti-Lub, anti-k (-Chellano), Antistoff mot høyprevalensantigen (> 99 % av befolkningen er positive)

Autoantistoff kan maskere alloantistoff: Reaksjoner mot alle panelcellene, inklusive autoceller, kan skyldes… Autoantistoff Varmetype Kuldetype Autoantistoff kan maskere alloantistoff: Demaskeres ved autoadsorpsjon (Autoantistoffet bindes til pasientens RBC etter at cellenes bindingskapasitet er økt ved eluering eller forsterkning (PEG)) Dersom pasienten er transfundert siste tre måneder vil autoadsorpsjon være upålitelig. Alloantistoff kan bli adsorbert til donorceller.

Korrekt identifikasjonen av antistoff? Etter identifisering må pasientens celler types for mistenkt antigen Dersom cellene er positive for antigenet: identifikasjonen er feil (OBS unntak: anti-D hos partiell D autoantistoff) Dersom negative: identifikasjonen aksepteres ved transfusjon velges blod som er negativt for antigenet

Rekombinante blodgruppeantigener til antistoffidentifikasjon Ved multiple antistoff: Reagerer bare med ett av antistoffene Kan også brukes til å eluere vekk klinisk irrelevant antistoff for å identifisere maskerte antistoff Ved antistoff mot høy-prevalensantigener eller sjeldne antigener Slipper å langtidslagre RBC med spesielle fenotyper Én brønn, ett antigen Lenger holdbarhet på reagenser enn på celler Yta = Cartwright Curr Opin Hematol 2009, 16:473–479

Assayformater Fastfaseassay Cellebaserte assay ELISA Beadbaserte metoder: Luminex Flowcytometer Cellebaserte assay Antigener som passerer membranen flere ganger

Curr Opin Hematol 2009, 16:473–479

Problemer med rekombinante blodgruppeantigener Går én eller flere ganger gjennom membranen? Multipassasjeproteiner må uttrykkes på membranoverflate av celler (Rh, Duffy, Kidd) Hvordan forhindre falske positive p.g.a. HLA-antistoff? Posttranslasjonelle modifikasjoner Glykosyleringer Disulfidbindinger Må gjerne bruke eukaryote ekspresjonssystemer Interaksjon mellom flere membranproteiner HLA-1 antigener kan nedreguleres v.h.a. RNA-interferens

Blodforlik: passer giver og mottaker sammen? Enkelt forlik påviser IgM i pasientplasma rettet mot givers RBC (saltvann ved romtemperatur) Test på ABO-forlikelighet Positivt enkelt forlik skyldes oftest forbytting av prøve Utvida forlik påviser IgG i pasientplasma rettet mot givers RBC (IAT ved 370 C)

”Veilederen” om enkelt forlik: Før transfusjon av erytrocytter skal det være utført enkel forlikelighetsprøve. Prøve som ikke er eldre enn 4 døgn. …… kan erstattes av elektronisk forlik.

”Veilederen” om forlik: Ved transfunsjon til barn yngre enn ei uke: forlik mot mors serum (om mulig). Til barn mellom 1 uke og 3 måneder er to alternativ likeverdige: • Utvida forlik mot mors serum • Barnet kan få ABO- og Rh(D)-typelikt blod om DAT er negativ hos barnet, og det ikke er påvist irregulære blodtypeantistoffer hos mor.

”Veilederen” om elektronisk forlik: ……kontroll i edb-systemet av at transfusjonsblodets ABO-type er forlikelig med mottakerens ABO-type. Transfusjonsblodets ABO-type skal være kontrollert ved aktuelle blodgivning. Pasienten skal være typet i prøve ikke eldre enn 4 døgn

”Veilederen” om utvida forlik (modifisert) Før transfusjon til pasient med antistoff: alltid utvida forlik. Blodgiveren skal være typet negativ to ganger for antigenet. Én typing er tilstrekkelig dersom antistoffet denne gangen reagerte med alle testcellene som var positive for antigenet. Ved Kidd-antistoff bør typingen alltid utføres to ganger. Må i prinsippet type to ganger i samme prøve, dersom ikke typet før. Veilederenn utgave 6: Den ene typingen kan erstattes av utvidet forlikelighetsprøve dersom antistoffet reagerer i indirekte antiglobulinteknikk med alle testceller som er positive (både homo- og heterozygote) på det aktuelle antigen i denne undersøkelsen.

Biologisk forlik til pasienter med autoantistoff Kan utføres hvis pasientserum ikke lar seg forlike med noen blodenheter og pas. må ha blod Gi mest mulig fenotypelikt blod Transfunder 10 – 20 ml raskt, deretter reduseres dråpetakten til et minimum, og pas. observeres for tegn til transfusjonsreaksjon. Deretter normal hastighet under kontinuerlig oppsyn. TAKK!