Oversikt RNA polymerase I RNA polymerase III RNA polymerase II proteinfaktorer og promoter/gen-organisering RNA polymerase III RNA polymerase II Kromatin som medspiller 80% av total RNA syntese fra disse ”Oddpols”

RNA polymerase I (RNAPI)

Klasse I gener (rRNA) transkribert av RNA polymerase I (RNAPI) RNAPI syntetiserer kun en type RNA: ribosomalt RNA En transkripsjonsenhet (7.5 kB) Multiple tandem-gener for å øke rRNA-produksjonen 50 - 10 000 genkopier avhengig av art

Nucleoli RNAPI lokalisert til nucleoli (ribosom-fabrikker)

Klasse I gener (rRNA): promoter-organisering Repeterte gener med promotere imellom Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter Core UPE Terminator elementer Enhancere

Klasse I gener (rRNA): Hjelpefaktorer involvert Repeterte gener med promotere imellom Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter UBF UBF SL1 TTF-1 RNAPI Core UPE Terminator elementer Enhancere

RNA polymerase III (RNAPIII)

Klasse III-gener transkribert av RNA polymerase III RNAPIII syntetiserer et fåtall ulike RNA som er små, stabile og ikke-translaterte tRNA, 5S rRNA, 7SL RNA, U6 snRNA ++

Promotere - tre typer Typer promotere Type I: som i 5S rRNA genet, A-I-C blokker Type II: som i tRNA genene, A+B blokker Type III: atypiske uten intrageniske elementer A I C +1 +50 +64 +80 +97 +120 A B +1 +8 +19 +52 +62 +73

Klasse III gener transkribert av RNA polymerase III Promotere med intrageniske elementer Mutasjoner endrer både promoter og produkt Polymerasen må lese igjennom aktiverende transkripsjonskomplekser A-blokk B-blokk

Klasse III gener: hjelpefaktorer som deltar Type II promotere - mest klassiske Sekvens: TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC A B TFIIIB TBP

Klasse III gener: hjelpefaktorer som deltar Type I promotere en type gen, en spesial faktor TFIIIA Sekvens: TFIIIA - TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC TFIIIA A I C TFIIIB TBP

RNA polymerase II (RNAPII)

Understanding transcription - Increasing complexity 80ties 70ties Figure 1.   Fundamental elements of eukaryotic transcriptional control. (A) Early studies led to the identification of multiple eukaryotic RNA polymerases and the mapping of promoter and enhancer DNA sequences. Core promoter elements (grey) that direct transcription by RNA Pol II (yellow, green shading) include the TATA box (TATA), the initiator (INR), and the downstream promoter element (DPE). Promoter-proximal basal level enhancer elements (BLE, GC box, CCAAT box, green) were found in many genes; however, gene-specific signal-responsive distal enhancer elements were also identified and are represented here as the hormone responsive element (HRE, purple) and nuclear factor element (NFE, blue). (B) Sequence-specific DNA-binding transcription factors that were isolated biochemically include specificity protein-1 (Sp1, green), families of activator proteins (i.e., AP-1, green), CCAAT enhancer-binding proteins (C/EBP), steroid receptors (i.e., glucocorticoid or GR, purple) and tissue-specific transcription factors (i.e., NF- B, blue). Components of the core initiation machinery required by RNA Pol II for promoter recognition and basal transcription from naked DNA were also fractionated biochemically, including TATA-binding protein, (TBP, red) and general transcription factors (TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF and TFIIH, purple). (C) Because TBP is insufficient for activated transcription, discovery of TAF subunits (orange) within TFIID revealed a requirement for co-activators to mediate activator responsiveness. Depicted here is one example of a specific and functional interaction between Sp1 and Drosophila TAF110 (human TAF130). (D) Many co-activators and co-repressors were subsequently found to be required for mediating signals between sequence-specific transcription factors and the core machinery. For further discussion pertaining to the specific co-regulators depicted, see text and Table 1. 90ties Today Lemon and Tjian 2000 Genes Dev. 14:2551-69

Klasse II-gener transkribert av RNA polymerase II Mediator Signal RD RNAPII TF TAD TFIID DBD Transcription factors TBP Chromatin GTFs TATA Enhancer Promoter Nucleosomal template - chromatin modifying activities

Språket: cis-elementene

cis-elementenes funksjon = Templater for kompleksdannelse The function of cis-elements is being templates for the assembly of multiprotein complexes

Promoter- organisering core promoter oppstrøms regulatoriske element Enhancere Boundary elements LCR - locus control regions Promoter- organisering

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II Subklasser av RNAPII-promotere mRNA-kodende TATA+ INR+ både TATA og INR uten TATA, uten INR snRNA-kodende

Noen typer cis-elementer UPE - Upstream promoter elementer Binder konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler Lokalisert nær TATA/INR (innen ca. 200 bp) Eksempler CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) GC-rike bokser - binder Sp1 Regulatoriske elementer 1. Responsive elementer eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heat shock, glucocorticoider 2. Celletypespesifikke elementer Lokalisert innblandet med UPE

Enhancere Distale elementer - Enhancere Øker kraftig aktiviteten av en promoter virker over lang avstand, uavh. av orientering, upstream/downstream Drosophila wing margin enhancer: 85 kb upstream TSS Immunoglobulin Hm enhancer: i 2. Intron T-cell receptor a-chain enhancer: 69 kb downstream samme cis-elementer som proksimalt multiple cis-elementer innen et lite område (50 bp - 1.5 kb) cis-elementer for mange ulike faktorer responsive/vevsspesifikke avhengig av sammensetning

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

RNA polymerase II Core med aktivt sete RPB1 (´-like)binder DNA  Prokaryot  RNA polymerase II  ´  Eukaryot DNA-bindende Core med aktivt sete RPB1 (´-like)binder DNA RPB2 (-like) binder NTP RPB3 (-like) assembly factor Felles subenheter RPB5, 6 og 8 felles for RNAPI-III Til forskjell fra prokaryot RNAP, er RNAPII ikke i stand til spesifikk promoter-gjenkjenning NTP-binding

CTD - ”C-terminal domain” Hale på største subenhet: (YSPTSPS)n n = 26 i gjær, 52 human pol.II hydrofil eksponert hale Unik for RNAPII Essensiell funksjon in vivo  >50% letalt

CTD- funksjon Fosforylering: (YSPTSPS)n Reversibel fosforylering på både Ser og Tyr Fosforylering endres gjennom transkripsjonssyklus Fosforylering skjer etter PIC assembly defosforylering av fri pol eller ved terminering

Fosforylerings-syklus

CTD funksjon Initiering Promoter clearance Elongering Rolle i “rekruttering” av RNAPII til promoter bare ufosforylert pol deltar i PIC-assembly Promoter clearance RNAPII går over i hyperfosforylert elongeringsmodus CTD fosforylering bryter interaksjoner og RNAPII frikobles fra PIC Elongering Samtidig: CTD fosforylering danner nye interaksjoner med elongeringsfaktorer En rekke nye CTD-bindende proteiner identifisert siste år med funksjoner i splicing og terminering Tett kobling: transkripsjon - pre-mRNA prosessering

CTD binder også en rekke faktorer Holoenzym = Mediator + core RNAPII Mediator RNA processering RNAPII = ”mRNA factory” som utfører koblet transkripsjon, capping, splicing og prosessering av 3´-ende

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

GTFs - generelle transkripsjonsfaktorer Hjelpefaktorer som dirigerer RNAPII til promoter Trinnvis oppbygging Dannelse av PIC - pre-initiation complex

1. Trinn: TATA bindes av TBP TBP binder TATA - sekvensgjenkjenning minor groove kontakt TBP binder også en rekke andre polypeptider aktivatorer TAFs (kalles da TFIID = TBP + TAFs) GTFs (TFIIB, TFIIA) TBP = universell TF involvert i alle 3 tr.systemene TBP i SL1, TFIID, TFIIIB protein DNA

TBP = sadel (med TATA som hest) 3D: Sadel-struktur Konkav innerside binder DNA i minor groove via 10-stranded antiparallelt b-sheet Konveks overside binder prot via 4 a-helikser stigbøyler (“stirrup”) på hver ende

TBP bøyer DNA (stakkars hest) Ikke slik, …….men slik

RNA polymerasen gjenkjenner en GTF-bundet promoter TBP TFIIA TFIIB Dette protein-promoter komplekset er det som gjenkjennes av RNAPII

PIC ”modnes” etter RNAPII- binding TFIIH: multisubenhet med CTD-kinase + helikase for smelting

Klasse II-gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

PIC-dannelse stimuleres av transkripsjonsfaktorer Dannelse av PIC styres av TFs som binder elementer oppstrøms Aktivatorer med høy sekvens-spesifisitet Rekrutteringspunkt for assembly av komplekser

(Oppstrøms) Transkripsjonsfaktorer TAD DBD N C Modulær oppbygning - iallfall 2 domener: 1. DBD - DNA-bindingsdomene 2. TAD - transaktivatordomene DBD: grunnlaget for gruppering i TF-familier Sinkfingre, kjernereseptorer, helix-loop-helix, leucin-zippere,osv. TAD ulike grupper Tre klasser med ulike targets sure domener (GAL4, steroid receptor) glutamin-rike domener (Sp1) prolin-rike domener (CTF/NF1) Strukturløse i fri tilstand - 3D i kontakt med target?

Mange ulike TFs Konstitutive TFs Regulatoriske TFs Konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler Binder cis-elementer lokalisert nær TATA/INR Eksempler CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) GC-rike bokser - binder Sp1 Regulatoriske TFs 1. Signal-responsive faktorer eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heat shock, glucocorticoider 2. Celletypespesifikke faktorer

Konstitutive Sp1 binder GC-bokser Noen eksempler

Synergi - mange faktorer stimulerer bedre enn én alene Mange kontakter gir mer effektiv PIC assembly

Familier - oppdelt etter DBD struktur Zinc finger bHelix-Loop-Helix (Max) STAT dimer Leucine zipper (Gcn4p) p53 DBD NFkB

Familie Sinkfingerproteiner TFIIIA fra Xenopus var første isolerte og klonede eukaryote TF Funksjon: aktivering av 5S RNA transkripsjon Primærstruktur TFIIIA Bygget opp som repetisjon 9x 30 aa minidomener + 70 aa unik region C-term Hvert minidomene konservert mønster av 2Cys+2His Hvert minidomene strukturert rundt et koordinert sink ion

Sinkfingerproteiner Sink koordineres av 2 Cys + 2 His Antall fingre varierer: 2-37 Antall medlemmer uvanlig mange S.cerevisiae genomet: 147 C.elegans genomet 535 Flere hundre humane Zif gener

3D struktur av sinkfingre Zif268 - første multi-finger struktur Hver finger et minidomene med -struktur major groove kontakt via -heliks i  gjenkjenning av basetripletter

Kjerne-reseptorer - en sinkfinger-variant To ”sinkfingre” utgjør en samlet enhet En finger kontakter DNA Dimeriserer ved binding til DNA

Kjernereseptorer Stor familie hvor DBD binder 2 Zn++ via tetraedrisk mønster av Cys Konservert DBD 70-80 aa Medierer transkripsjonell respons på komplekse ekstracellulære signal klassiske steroid hormoner sekretert fra endokrine celler  via blod  målcelle  diffusjon inn  binder reseptor  aktiveres  modulerer målgener Evolusjonsmessig koblet til multicellulære organismer

Gal4p - enda en sinkfinger variant (6 Cys + 2 Zn)

Leucin-zipper - nesten glidelås 60-80 aa motiv funnet i en rekke dimere TFs Prototypiske eks.: GCN4, Fos, Jun, C/EBP, ATF, CREB mange mulige dimer-partnere gir tallrike kombinasjoner Dimer-dannelse via parallell coiled coil av a-helikser (ZIP) Hver 7.aa = Leu 3.5 aa pr turn (coiled coil) hver 7.aa lik posisjon Alle Leu samme side og dimerisering via “leucine zipper”

Leucin-zipper - nesten glidelås Dimer via parallell coiled coil av a-helikser Hver 7.aa = Leu 3.5 aa pr turn (coiled coil) hver 7.aa lik posisjon Alle Leu samme side og dimerisering via “leucine zipper”

Kontakter DNA som en pinsett

HLH - helix-loop-helix - lignende variant med brutte helikser

Klasse II-gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

Koaktivatorer - brobyggere som også gir kromatin remodelering remodellering

En rekke koaktivatorer og korepressorer deltar

Klasse II-gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

Hvordan påvirker kromatin transkripsjon? .. som repressor Chromatin maintains a restrictive ground state by blocking association between Pol II basic transcription machinery and DNA while permitting many activators to bind to their target sites. TFIID TBP Activator

Transkripsjonsfaktorer fremmer PIC dannelse + åpning av kromatin Enzymes that covalently modify the nucleosomal histones ATP-dependent chromosomal- modifying enzyme

To måter å åpne kromatin på 1. Åpning av kromatin via styrt acetylering Histon-modifisering via HAT-aktivitet 2. Åpning av kromatin via styrt nukleosommobilisering ATP-avhengig prosess

Halene på histonene modifiseres som signaler til transkripsjon Acetylation Methylation Phosphorylation Ubiquitination ADP-ribosylation

Topologi Selv åpnet kromatin er en topologisk utfordring for RNAPII

Hvordan kan modifisering av histoner påvirke kromatin? Tradisjonell forklaring: Modifisering vil påvirke histonenes ladning, noe som igjen vil kunne gi en endret nukleosomstruktur og endrede egenskaper Nyere forklaring: Modifiserte aminosyrerester i histonene utgjør bindingsseter for andre proteiner som så avgjør kromatinets videre skjebne

Histonhalemodifikasjoner i eukromatin og heterokromatin Models for euchromatic or heterochromatic histone tail modifications. Schematic representation of uchromatin and heterochromatin as accessible or condensed nucleosome fibers containing acetylated (Ac), phosphorylated (P), and methylated (Me) histone NH 2 -termini.

Kombinasjoner av modifikasjoner forbundet med aktivt og inaktivt kromatin Examples of combinatorial modifications in histone NH 2 -terminithat are likely to represent “imprints” for active or inactive chromatin.

Synergistiske og antagonistiske modifikasjoner i halen av H3 og H4 Proposed synergistic (connected arrowheads) or antagonistic (blocked oval line) modifications in histone H3 and H4 NH 2 -termini. The arrow with the scissors indicates possible proteolytic cleavage of the H3 NH 2 -terminus.

Hvordan histonkoden oversettes Fig. 2. Translating the “histone code”. Described protein modules of histone-modifying enzymes that have been shown to interact with site-specific methylation (chromodomain) or acetylation (bromodomain) marks in histone NH 2 -termini. A protein module that would selectively recognize phosphorylated positions is currently not known. Abbreviations: HMT, histone methyltransferase; HAT, histone acetyltransferase; HDM, histone demethylase; PPTase, protein phosphatase; HDAC, histone deacetylase.

Proteolytisk modell for fjerning av stabil metylering fra histon H3 Fig. 3. A proteolytic model to remove “stable” methylation marks from histone H3. Abbreviations: Ub, ubiquitin-conjugating activity; Ub protease, ubiquitin-directed proteolytic activity. Depending on the chromatin environment and/or the nature of the ubiquitin signal, a methylated H3 NH 2 -terminus may be removed by proteolytic processing (left; see also Fig. 1D), or the entire H3 molecule may be degraded (right).

K9-metylering av histon H3 og HP1-protein i heterokromatin Nucleosomes (blue spheres) are cross-linked by the heterochromatin-associated HP1 proteins (golden chains). The affinity of HP1 for heterochromatin is generated by Suv39h-dependent H3-K9 methylation (metal hook). Artwork by Hannes Tkadletz (IMP).

Telomerer, heterokromatin og eukromatin Packaging of yeast telomeres. Binding of RAP1 protein may be a key nucleating event in the assembly of these complexes. Complexes of SIR3 and SIR4 proteins bind to the hypoacetylated histones, extending along the DNA; SIR2 is also critical for stable maintenance of the silenced state. SIR2: NAD-dependent histone deacetylase

MeCP2 – et protein som bindes til metylert DNA Bindes spesifikt til metylert DNA via et metyl-CpGG-bindende domene Rekrutterer transkripsjonsrepresjonskom-plekset mSin3A/HDAC Kan ”invadere” kromatin på en metyleringsavhengig måte og forskyve histon H1 fra kromatin in vitro Mutasjoner i mSin3A kan føre til Retts syndrom, en nevrologisk sykdom som stort sett rammer jenter Symptoms: Girls with Rett Syndrome appear to develop normally until 6 to 18 months of age. They then enter a period of regression, losing speech and hand skills they had acquired. Most girls develop seizures, repetitive hand movements, irregular breathing and motor-control problems. A slowing of the rate of head growth may also become apparent. The girls can live to adulthood, but most never regain the ability to use their hands or to speak.

Mulige måter å aktivere inaktivt kromatin på Hypotetisk aktivering av inaktivt kromatin ved to mekanismer

Hypotetisk samarbeid mellom metylering og histonaktivering for opprettholdelse av aktivt/inaktivt kromatin