Regulering av DNA Transkripsjon i Eukaryote Organismer ID, Kull 99, Vår 2001 Frank Skorpen IKM, DMF

Regulering av gen-uttrykk på mange nivåer Klargjøring av DNA Transkripsjon Initiering Stopp hnRNA prosessering mRNA Transport Translasjon Stabilitet Protein Kjemisk modifisering Prosessering Lokalisering Stabilitet

Gen-uttrykk reguleres primært ved regulering av transkripsjons-initiering Klargjøring av DNA Transkripsjon Initiering Stopp hnRNA prosessering mRNA Transport Translasjon Stabilitet Protein Kjemisk modifisering Prosessering Lokalisering Stabilitet

Nukleære RNA polymeraser RNA pol I transkriberer rRNA gener RNA pol II transkriberer protein-kodende gener (klasse II gener) RNA pol III transkriberer tRNA gener

Geners regulatoriske områder TRANSKRIPSJONSENHET 5’ 3’ Exon Intron TATAAT konsensus: Start TATA Inr -200 -50 -25 +1 Proximal Distal ENHANCER ELEMENTER CORE PROMOTER

Mulige transkripsjonsfaktor-bindende elementer kan identifiseres ut i fra DNA sekvens E2F

Forskjellige sett av aktivatorer aktiverer forskjellige gener B C Gen 1 A D E Gen 2

Forskjellige typer celler uttrykker forskjellige gener fordi de inneholder forskjellige sett av transkripsjons-aktivatorer Celletype I Celletype II B D E B A D E C A A A C

Transkripsjons-aktivatorer rekrutterer transkripsjonsmaskineriet til promoteren Aktiverings- domene TATA Inr DNA-bindings- domene -25 +1 CORE PROMOTER

Mange aktivatorer binder som homo- eller heterodimérer Dimériserings- domene TATA Inr -200 -50 Proximal Distal -25 +1 ENHANCER ELEMENTER CORE PROMOTER

Transkripsjons-aktivatorer: familier Helix-turn-helix Leucine zipper Helix-loop-helix Zinc finger andre

Helix-turn-helix Leucine zipper + NH2 COOH HOOC Leucine zipper proteiner fungerer som dimérer av to subenheter, hver delt i to helix-regioner. Leucine (L) residier i C- terminalen danner en hydrofob overflate for interaksjon mellom de to protein sub- enhetene. Positive aminosyrer N-terminalt for leucinene danner kontaktflaten med DNA. Helix-turn-helix 2 3 COOH 1 NH2 Helix-turn-helix motivet finnes i en rekke prokaryote regulatoriske proteiner og i homeodomain proteiner i eukaryoter. Helix 3 er “recognition helix” som kontakter major groove i DNA helixen. Helix 1 and 2 ligger over helix 3 og kan kontakte andre proteiner.

Helix-loop-helix C2H2 zinc finger + Zn Diagram av en zinc finger bestående av to cysteine (C) og to histidine (H) residier koordinert rundt et sink atom. Andre høyt konserverte aminosyrer i denne klassen av zinc fingre er også vist. Zinc fingre kan også bruke fire cysteiner til å koordinere zinc atomet, slik som i steroid hormon receptorer. + NH2 HOOC COOH Helix Loop P C L H Zn Y COOH C2H2 zinc finger NH2 Helix-loop-helix proteiner har to helixer bundet sammen med en loop av ukjent struktur. Disse helixene danner overflaten for dannelsen av dimérer. En tredje helix rik på positive aminosyrer er ansvarlig for DNA-binding.

Transkripsjons-aktivatorer kan slås på og av PROTEIN- SYNTESE LIGAND- BINDING FOSFORYLERING BINDING TIL ANNEN SUBENHET INAKTIV P DNA-bindende subenhet AKTIV Aktiverende subenhet

Signal-aktivering av gener Steroid hormon reseptor Steroid hormon TRANSKRIPSJON P P Insulin Signal- kaskade Insulin reseptor

Aktivatorer rekrutterer RNA pol II og et sett av 5 generelle transkripsjonsfaktorer IIF IIH IIE IIB IID Aktivator TATA Inr -50 +1

TBP binder til TATA-element og danner en plattform for binding av de andre faktorene TAFIIs TBP Activator TATA Inr -50 +1

Rekruttering skjer vanligvis i to trinn: først TFIID, deretter resten av komplekset IIE IIH RNA pol II IIF IIB IID Aktivator TATA Inr -50 +1

Generelle transkripsjonsfaktorer og RNA pol II responderer ikke til aktivatorer in vitro IIF IIH IIE IIB IID Aktivator TATA Inr -50 +1

Aktivatorer virker vanligvis gjennom ikke-DNA-bundne ko-aktivatorer RNA pol II IIF IIH IIE IIB TBP The Core Srb/Mediator Complex Srb2, -4, -5, -6, and -7; (pos) Med1, -2, -4, -6, -7, and -8; (pos) Gal11, Sin4, Rgr1, Rox3, and Pgd1 (neg) Srb4 Srb10 CDK (neg) Srb11 Srb9 Activator TATA Inr -50 +1

In vivo foreligger DNA i form av kromatin. Kromatin virker hemmende på DNA transkripsjon. H2B H2A H3 H4 H1 DNA helix Nukleosom: 180-200 bp DNA tvunnet rundt en oktamer av histoner

Histon acetyltransferaser (HATs) og histon deacetylaser (HDACs) H2B H2A H3 H4 + H20 CH3 C=O OH S Coenzyme A SH

HAT enzymer kan dirigeres til promotere ved å binde til aktivatorer CREB c-Jun Fos P/CAF p300/CBP P/CAF: “p300/CBP-Associating Factor” p300/CBP, “CBP: CREB-binding protein” E2F-1 p53 Nukleosom

TAFII250 har intern HAT aktivitet TFIID TAFII250 HAT aktivitet Aktivator TATA

Mange repressorer fungerer ved å rekruttere HDAC aktiviteter E2F/DP Rb HDAC1 Deacetylering og represjon Mad Max SIN3 YY1 HDAC2

SWI/SNF bruker ATP til å remodellere nukleosomstrukturer Swi - Snf Complex ATP ADP + Pi Swi2 Aktivator +1 TATA Inr

SWI/SNF kan rekrutteres som del av RNA pol II holoenzym Swi - Snf Complex ATP ADP + Pi Swi2 RNA pol II holoenzym Aktivator +1 TATA Inr

Rekruttering ved synergi RNA pol II IIF IIH IIE IIB Swi - Snf ATP ADP + Pi HATs Srb/Mediator TAFII250 TBP Aktivator +1 TATA Inr DNA-bøyende ko-aktivator

Modell av pre-initieringskompleks Aktivatorer Generelle (basale) transkripsjonsfaktorer Ko-aktivatorer/ TBP-assosierte faktorer RNA pol II

Produksjon av mRNA Exon Intron 5’ 3’ Kopiering til pre-mRNA AAAAAAA-3’ Fjerning av introns, påsetting av m7G(5’)pp cap, 3’-ende-kløyving og polyadenylering 5’-m7Gpp mRNA Exon Intron

elongating RNA pol II (Pol IIo) RNA pol II holoensym er involvert i både RNA-kjede forlengelse, RNA prosessering, og terminering av transkripsjon Fjerning av intron elongating RNA pol II (Pol IIo) pre mRNA AAUAAA Kløyvings- / polyadenylerings- faktorer Elongerings- Spleise- CTD (YSPTSPS)n

Oppsummering: Transkripsjonsaktiviteten av et gen bestemmes av hvor effektivt RNA pol II holoenzym rekrutteres til promoteren Dette bestemmes av den synergistiske effekten av de til enhver tid bundne aktivatorer Gener reguleres forskjellig fordi de binder forskjellige sett av aktivatorer Aktivatorer virker vanligvis gjennom ikke-DNA-bundne ko-aktivatorer

In vivo foreligger DNA i form av kromatin In vivo foreligger DNA i form av kromatin. Kromatin hemmer transkripsjons-initiering Assosiert med RNA pol II finnes enzymaktiviteter som re-modellerer kromatin, slik som SWI/SNF og HATs/HDACs SWI/SNF og HATs/HDACs kan også rekrutteres via interaksjon med sekvens-spesifikke aktivatorer Forskjellige promotere har forskjellige krav til sammensetningen av RNA pol II holoenzym