Tre temaer 1. Protein ekspresjon 2. DNA-Bindingsassay: EMSA Litt generelt om ekspresjon T7-systemet for ekspresjon i E.coli cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3) Rensing via ionebytterkromatografi 2. DNA-Bindingsassay: EMSA Bindingsreaksjon, kompleksdannelse Elektroforetisk separasjon 3. Radioaktiv merking av oligonukleotid Oligonukleotid m/ 5´-OH Polynukleotid kinase (PNK) g-[32P]-ATP

Ukens program SDS-PAGE EMSA MANDAG TIRSDAG ONSDAG Plasmid konstruksjon Kultur med E.coli induseres til protein produkasjon E.coli høstes, lyseres og ultrasentrifugat preppes I ventetiden: Merking av DNA-probe til EMSA Pakking av kolonne til protein rensing Støpe PA-geler (SDS-PAGE og EMSA) TIRSDAG Rensing av protein på S-Sepharose SDS-PAGE over natt EMSA med autoradiogram over natt ONSDAG Farge geler, fremkalle film, Vurdere resultat cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

Noen generelle prinsipper cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

Ekspresjon og rensing - mange trinn å optimalisere cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon Protein rensing E.coli Ekspresjon +antibiotika

Valg av vert for proteinekspresjon Mengde Modifikasjon E. coli Rask vekst, høy produksjon Fravær av euk.modifikasjoner Gjær Rimelig rask vekst Noen modifikasjoner Animalske celler i kultur Langsom, kostbar vekst Relevante modifikasjoner Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli +antibiotika Ekspresjon Protein rensing

Ekspresjonsvektorer - grunnleggende oppbygning E.coli ori AmpR Ekspresjonsvektorer - grunnleggende oppbygning MCS Plasmider som inneholder elementer som dirigerer ekspresjon av innsatt cDNA Promoter Effektiv + Regulerbar Terminator MCS - multi cloning site Seleksjonsmarkør ApR - ampicillin resistens markør Koder for ß-lactamase som gir resistens overfor ampicillin. Ampicillin inhiberer peptidoglycansyntese slik at cellevegg ikke dannes. Ødelegger derfor bare voksende celler. CmR - chloramphenicol resistens markør Kloramfenikol inhiberer protein syntesen. Resistensgenet (CAT) koder for enzymet ”chloramphenicol acetyl transferase” som inaktiverer kloramfenikolet. AmpR CmR E.coli +antibiotika

cDNA innskudd Det som dirigerer protein syntesen E.coli ori AmpR MCS Det som dirigerer protein syntesen AmpR CmR E.coli +antibiotika

Hva genteknologien har tilført protein biokjemien? 1. Protein ekspresjon forenklet Kilde: ikke lenger begrenset til naturlige. Når cDNA er tilgjengelig, kan tilhørende protein produseres i store mengder i en rekke verter Laboppgave: normal kilde = stamceller i benmarg, recombinant kilde = E.coli 2. Enkel generering av mutanter Punktmutasjoner etter ønske Studie av subdomener Tillegg av ”tags” som forenkler påvisning eller rensing

Fordeler ved in vitro mutagenese Punktmutasjoner - mutagenese via PCR Eks.: Blir serin 116 fosforylert? Ved mutagenese lages en mutant S116A (ikke fosforylerbar uten OH-gruppe) som testes. Hvis villtypen men ikke mutanten fosforyleres, kan spørsmålet besvares positivt. Ekspresjon av subdomener Jfr PCR-forelesning Laboppgave: R2R3 svarende til aa 88 - 188 i c-Myb Påsetting av ”tags” som letter rensing Tags er små tilleggssekvenser som gir proteinet evne til å bindes spesifikt til visse kolonner His6-tags gir binding til immobilisert Ni2+-kolonner GST-tags gir binding til glutathion kolonner Epitoper (HA, FLAG) binder immobilisert antistoff Protein X Protein Y Protein Z

Fordelen med tags - rensing og påvisning cDNA * * * * Plasmid konstruksjon AmpR Immunfarging via tag Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing i et trinn Via tag-binding til kolonne +antibiotika

Ekspresjon og rensing - mange trinn å optimalisere Kodon-bruk • Flere kodon-muligheter pr aa • Human pref ≠ E.coli, kan hemme translasjon cDNA Plasmid konstruksjon Signal for translasjon • RBS - AGGAGG 9±3 foran AUG • AUG - AUG > GUG,UUG,AUU,AUA • Stop kodon - UAA best AmpR Transformasjon Protein rensing E.coli Ekspresjon +antibiotika

c-Myb proteinet SDS-PAGE EMSA Plasmid konstruksjon Transformasjon cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

SDS-PAGE EMSA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

T7 systemet SDS-PAGE EMSA Plasmid konstruksjon Transformasjon cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

T7 systemet

T7 systemet for ekspresjon Kaskade effekt Et gen, mange transkript Et transkript, mange translaterte protein Høyt nivå av mRNA for cDNA LysS koder for lysozym med to funksjoner Inhibitor av T7 RNA polymerase (holder basalnivå nede) Letter lysis ved å fordøye cellevegg

Praktiske sider ved laboppgaven cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

Dyrking og induksjon Celle- tetthet Renhet: SDS-PAGE +IPTG Høsting Syntese av protein Renhet: SDS-PAGE DNA-bindende aktivitet: EMSA

Protein ekspresjon - ekstraksjon fra celler Mekanisk Sonikering (ultralyd) Presser Enzymatisk Celleveggfordøying Kjemisk detergenter +antibiotika

Lysis av E.coli Triton X-100: permeabilisering av plasmamembranen Myb lysozym Triton X-100: permeabilisering av plasmamembranen Lysozym lekker ut og angriper celleveggen Lysat dannes Ultrasentrifugering gir ”cellefritt ekstrakt” Peptidoglycan cellevegg Cellefritt ekstrakt

Løselighet av rekombinant protein Syntese To konkurrerende prosesser: Folding til løselig protein Aggregering til uløselig protein (”inclusion bodies”) Temperatur-avhengig balanse Hvis mye er uløselig, kan utbyttet av løselig protein forbedres ved å senke dyrkingstemperatur Test av løselighet Uttak fra kultur - cellepellet kokt i SDS = totalt protein Lysat - ultrasentrifugering - supernatant = løselig protein Folding Løselig Aggregering Uløselig 37oC Løselig Uløselig 25oC Løselig Uløselig

Protein rensing - laboppgave: ionebytter Separasjon av proteiner på grunnlag av ulike antall ladninger tilgjengelig for interaksjon med kolonnematerialet pH bestemmer ladning på kolonne og protein Ionestyrke bestemmer likevekt/affinitet, varieres ved gradient-eluering +antibiotika Protein rensing

Kromatogram A280 Salt- gradient Renhet: SDS-PAGE Indusert c-Myb protein Proteiner som Ikke binder ionebytter Salt- gradient Renhet: SDS-PAGE DNA-bindende aktivitet: EMSA

Analyse ved SDS-PAGE Induksjon OK - størrelse - intensitet -IPTG +IPTG ultra Toppfraksjoner Induksjon OK - størrelse - intensitet Indusert prot = løselig Effektiv rensing

Tre temaer: protein ekspresjon T7-systemet for ekspresjon i E.coli cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3) Rensing via ionebytterkromatografi 2. DNA-Bindingsassay: EMSA Bindingsreaksjon, kompleksdannelse Elektroforetisk separasjon 3. Radioaktiv merking av oligonukleotid Oligonukleotid m/ 5´-OH Polynukleotid kinase (PNK) g-[32P]-ATP

EMSA: electrophoretic mobility shift assay - prot +prot Grunnprinsipp: Kompleks av protein+DNA har redusert mobilitet i nativ PA-gel relativt til DNA-probe Mobilitet bestemmes av Størrelse - proteinbinding øker størrelsen Ladning - probens ladning reduseres ved binding av basisk protein Form - kan påvise konformasjonsendring i DNA DNA-probe Duplex på 20-200 bp radioaktivt merket Spesifikk sekvens gjenkjent av protein Samme assay til en rekke ulike DNA-bindende protein ved å bytte sekvens

EMSA: enkel assay med mange bruksområder - prot +prot Enkelt assay-system for DNA-binding Følge rensing Påvise spesifikk DNA-bindende faktor i celleekstrakt Analytisk bruk Teste mutanter i protein eller DNA Bestemmelse av bindingskonstanter Bestemmelse av kinetiske konstanter Kan påvise indusert konformasjonsendring i DNA Syntetisk bruk Preparativ isolering av ukjent faktor

EMSA: trinn i praktisk oppsett - prot +prot Lage DNA-probe radioaktivt merket Støpe PA-gel Ikke-denaturerende gel Bindingsreaksjon Optimale betingelse for kompleksdannelse Elektroforese Autoradiografi

Tre temaer: protein ekspresjon T7-systemet for ekspresjon i E.coli cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3) Rensing via ionebytterkromatografi 2. DNA-Bindingsassay: EMSA Bindingsreaksjon, kompleksdannelse Elektroforetisk separasjon 3. Radioaktiv merking av oligonukleotid Oligonukleotid m/ 5´-OH Polynukleotid kinase (PNK) g-[32P]-ATP

Merking av oligo i 5´-ende PNK polynukleotid kinase O-P-O-P-O-P O H O- ATP

EMSA: tester for spesifisitet Ref +spes +uspes Konkurranse (competition) Utkonkurrering med overskudd av spesifikk versus uspesifikk oligo Med kompleks med kjerneekstrakt: ulike komplekser identifiseres utfra hva de utkonkurreres med Supershift Tilsetting av antistoff mot DNA-bindende protein påvirker komplekset på en av to måter 1. Komplekset binder Ab og migrerer langsommere (=supershift) 2. Kompleksdannelse inhiberes fordi Ab blokkerer DNA-bindende domene: bortfall av kompleks Ref +Ab +IgG

EMSA: konkurranse-test for spesifisitet Ref +spes +uspes Uspesifikk oligo Spesifikk oligo

EMSA: spesifisitetstest viktig ved analyse av ekstrakter Ref +stimuli Faktor X? EMSA i komplekse blandinger EMSA kan brukes til å påvise tilstedeværelse av ulike DNA-bindende faktorer i celleekstrakter Vanlig med komplekst mønster av kompleksbånd - hvilke tilhører hvilken faktor? Utkonkurrering med overskudd av spesifikk oligo benyttes til å identifisere ulike komplekser Supershift Alternativ analyse med antistoff mot DNA-bindende protein: kan gi supershift eller bortfall av kompleks Faktor Y? Ref +X-oligo +Y-oligo Ref +anti-X +anti-Y

EMSA: 2 labforsøk Assay for tilstedeværelse av c-Myb Råex Fraksjoner Assay for tilstedeværelse av c-Myb Konklusjon: c-Myb aktivitet tilstede i cellefritt ekstrakt og i toppfraksjon Konkurranse (competition) Utkonkurrering med overskudd av spesifikk versus uspesifikk oligo Konklusjon: indusert c-Myb R2R3 protein binder oligonukleotidet spesifikt Ref +spes +uspes

Radioisotoper brukt i biokjemisk arbeid Av ulike isotoper er noen ustabile radioisotoper som avgir stråling To typer aktuelle i biokjemisk arbeid: b- og g-stråling b- stråling: Neutron proton+ + b- + antineutrino Atomnr øker +1 (C N, P S) b- partikler lette å detektere Random prosess - energispektrum g stråling: tunge radioisotoper (125I) Multistep decay som gir høyenergi-fotoner 12C 13C 14C stabile ß- partikkel 14N

Radioaktivitet - enheter og måling Radioaktiv stråling måles i Ci eller Bq Ci (Curie) = desintegrasjoner fra 1 g radium = 2.2 x1012 dpm Praktisk omregning: 1 µCi = 2.22 x 106 dpm SI enhet = Becquerel (Bq) = 1 dps Praktisk omregning: 1 µCi = 3.7 x 104 Bq Måling skjer i scintillasjonsteller b- stråling scintillasjonstelling i løsning hvor stråling omdannes til lys Løsningen (”tellevæske”) inneholder fluoroforer For 32P kan man bruke vann (Cerenkov telling) Max 40% effektivitet g stråling scintillasjonstelling i fast fase hvor stråling omdannes til lys Tellereffektivitet = cpm/dpm x 100%

Radioaktivitet - regler for sikkerhet Unngå å få isotoper innabords Munnpipettering forbudt, avtrekk hvis flyktige forbindelser Unngå hudkontakt Bruk alltid hansker Bruk skjermbeskyttelse mot høyenergi-stråling Vær nøye med å unngå ”søl” Bruk isotop-lab ved høye doser, sjekk alltid benk med monitor etter bruk, vask utstyr grundig etter bruk og sjekk med monitor Kast alt kontaminert avfall (løsninger og plast) i dertil egnede kontainere Ved jevnlig bruk, benytt dosimeter