PCR - polymerase chain reaction Prinsipp og metode

PCR - prinsipp PCR er primer-mediert enzymatisk amplifisering av spesifikke DNA-sekvenser (genomisk eller klonet) ca. 10 år gammel metode som har revolusjonert molekylærbiologien (og gitt Nobelpris til Kary Mullis) Syklisk prosess av tre trinn denaturering av dsDNA templat annealing av to motsatt rettede primere til ssDNA templat elongering av ny komplementær DNA v.hj.a. varmestabil DNA polymerase Akkumulering av dsDNA med eksponesiell hastighet Hver syklus skulle i teorien doble mengden DNA I praksis er effektiviteten av hver syklus <1 slik at Y = X (1 + eff.)n Amplifisering når et platå etter 105 til 109 fold økning

PCR - prinsipp En syklus 94oC 72oC 55oC Tid Tid Temp. Denaturering Elongering Tid Tid Temp. 55oC Annealing

Dobling trinn for trinn

Eksponensiell amplifikasjon

Eksponensiell økning PCR-basis: N = N0 x 2n Amplification curve N: antall amplifiserte molekyler N0: opprinnelig antall molekyler n: antall sykler Amplification curve

Bruk Analytisk Syntetisk Påvise nærvær av en spesifikk sekvens i et biologisk materiale Spesifisitet bestemt av primere, forventet størrelse, eventuelt hybridisiering Medisin - diagnostikk (f.eks påvise mutasjoner knyttet til sykdom), Mikrobiologi - påvise mikroorganisme, Rettsmedisin - biologiske spor, Arkeologi osv. Syntetisk Verktøy for å modifisere DNA Innen forskning: Lett å legge til startkodon, stoppkodon, restriksjonsseter, mutagenese

PCR enzymer Varmestabil DNA polymerase Vanlig brukte 5´-3´-Exonuclease dNTP  DNA templatavh. primeravh. Vanlig brukte Taq DNA pol. Vent DNA pol. Pfu DNA pol. 5´-3´-Exonuclease Degraderer nedstrøms primer - lineære templater optimalt 3´-5´-Exonuclease Proofreading - korrigerer feilinkorporeringer Taq uten proofreading, Vent og Pfu med proofreading

Primere Typisk lengde 15 -28 nukleotider 50 - 60% GC Tm bestemmes av sekvens og reaksjonsbetingelser Tm = temp hvor 50% av primer har hybridisert (dsDNA) og 50% er fri (ssDNA) Kan grovt estimeres som Tm = 2x [#AT-bp] + 4x [#GC-bp] Kan mer presis estimeres av dataprogrammer Salt stabiliserer: Tm avtar med fallende ionestyrke Optimal annealingstemp = Tm - 5˚C normalt mellom 55 og 72 ˚C Balansert Tm for de to primere Konsentrasjon: 0.1 - 0.5 µM For høy kons fremmer misinkorporering, falsk priming og primer-dimer dannelse

Primere - kriterier for design Annealing av primer til templat kritisk trinn i prosessen optimalt: bare annealing til spesifikke områder i praksis: også falsk priming til uspesifikke områder Unngå komplementære 3´-ender - fremmer primer-dimer 40 - 60 bp produkt forbruker primere og enzym, reduserer utbytte Unngå G-serier og C-serier (> 3nt) i 3´-enden fremmer falsk priming i GC-rike områder Unngå interne palindromer

Primernes 5´-ende: sted for tillegg 5´-ende av primerne trenger ikke være komplementære med templat DNA Blir presist inkorporert i sluttprodukt Egnet til å legge til restriksjonskuttesteder, promotersekvenser, ATG-translasjonsstart, stop kodons osv. ATG Stopp PCR Restriksjonskuttested ATG Gen Stopkodons Restriksjonskuttested

DNA templat Renhet ikke kritisk Mengde Også RNA kan brukes En av fordelene med PCR er nettopp at spesifikke DNA-molekyler i en kompleks blanding kan amplifiseres (nåla i høystakken identifiseres ved å amplifisere nåla) Basis for bruk av PCR i kriminalsaker Kurset: amplifisere direkte fra en bakteriekoloni Forurensinger kan inhibere DNA polymerasen Mengde 1 molekyl nok 100.000 molekyler anbefales nanogram mengder av klonet DNA mikrogram mengder av genomisk DNA Også RNA kan brukes omdannes til ssDNA templat via revers transkriptase

PCR-maskiner og rør Maskiner: programmerbar varmeblokk “Hold-time” må være tilstrekkelig til temp.likevekt PCR-rør: tykkelsen av plastveggen bestemmer tid for temp.likevekt polypropylen tynnveggede optimalt Ned til 15 sek ekvilibreringstid Problem med fordampning: Oljedekke over Varme i lokk hindrer kondensasjon og væsketransport Olje PCR-mix Varme i lokk hindrer kondens PCR-mix

Valg av PCR-syklus Denaturering temp. og tid Annealingstemp. og tid 94 ˚C i 5 min., 95 ˚C i 30 sek., 97 ˚C i 15 sek. For høy: enzymet inaktiveres For lav: snapback av templat Annealingstemp. og tid Temp. justeres for hvert sett av primere Tid: 30 sek nok Elongeringstemp. 72 ˚C Elongeringstid 35 -100 nt pr sek Justeres for hver reaksjon utfra regel om at man pr minutt kan lage 1- 2 kb DNA Kan økes utover i programmet når enzym/templat ratio avtar Antall sykler Med størrelsesorden 105 templatmolekyler brukes 25 -30 sykler Bruk ikke flere enn nødvendig (bakgrunn øker) Denaturering 94oC 72oC Elongering Tid Tid Temp. 55oC Annealing

Optimalisering av reaksjonsbetingelser Mg++ konsentrasjon DNA pol. krever fri Mg++ [Mg++ ] påvirker flere trinn (annealing, polymerase osv) Flere komponenter i blandingen (særlig dNTP) binder Mg++ . Viktig at det er tilstrekkelig overskudd av fri [Mg++]. Ved optimalisering: varier [Mg++] i trinn på 0.5 mM dNTP (ekvimolar blanding av dGTP, dATP, dCTP, dTTP) Optimalt mellom 20 og 200 µM 20 µM i 100 µl nok til 2.6 µg DNA (400 bp) Lav konsentrasjon best mhp spesifisitet og fidelitet Stabilitet: 50% igjen etter 50 cycler

Optimalisering av reaksjonsbetingelser forts Buffer og salt 10 - 50 mM TrisHCl som buffer pH 8.3 justert ved RT (husk temp avh.: gjennom sykler 6.8 - 7.8) Opptil 50 mM KCl for å fremme primer annealing (for høy salt hemmer enzym) Enzymmengde Taq DNA pol.: 1 - 2.5 enheter Ved optimalisering: varier fra 0.5 - 5 enheter pr. 100 µl For mye enzym: uspesifikke produkt For lite enzym: lavt utbytte Andre tilsetninger BSA for å stabilisere enzymet Ikke-ioniske detergenter (Tween 20) også for å stabilisere enzymet DMSO eller glycerol kan ha fordelaktig effekt på vanskelige templater

Analyse av PCR-produkt Agarosegel elektroforese Forventet Størrelse - et bånd Mange ekstra bånd Bånd av feil størrelse Troubleshooting?

Troubleshooting Problem: ingen produkt Problem: falske produkt TILTAK: Optimalisering av reaksjonsbetingelser (titrere enzym, Mg..) Optimalisering av temperaturer / tider i PCR programmet Problem: falske produkt TILTAK : Høyere annealingstemp. Hot start “Strupende” betingelser: mindre enzym, mindre dNTP, færre sykler Renslighet (“carryover” problematikk) Problem: primer-dimer TILTAK : som over + design Problem: PCR-genererte mutasjoner Proofreading enzym Blanding av proofreading enzym og Taq Senke dNTP konsentrasjon

Stringens Hot start Voks Inaktivt enzym (AmpliTaq Gold) Mix av enzymer Tilsetning av enzym etter oppvarming hindrer elongering av falsk priming Voks holder komponenter adskilt inntil temp blir så høy at voksen smelter Inaktivt enzym (AmpliTaq Gold) reaktiveres etter inkubering ved 92-95 ˚C i 9-12 min Mix av enzymer Taq + proofreading varmestabil polymerase Den siste korrigerer feilinkorporering som stopper elongering

RT-PCR Mye brukt anvendelse av PCR To trinn RT for å detektere og kvantitere eukaryote RNA species isolert fra ulike vev eller cellulære kilder. To trinn 1. Første-tråd cDNA syntese med revers transkriptase, dNTP og primer 2. PCR Primer til første-tråd cDNA syntese pd(N)6 Primer (random hexamers) Not I-(dT)18 RT PCR

Real-time PCR: PCR til kvantitering av RNA/DNA RNA isolering cDNA-syntese PCR med fluorescense deteksjon Analyse med real-time PCR på et instrument som har on-line deteksjon av fluorescence

Deteksjon av PCR-produkt mens de dannes via fluorescense Alternativ II: Hybridiserings-prober måling av akkumulert spesifikk DNA Alternativ I: SYBR-green måling av akkumulert total DNA

Real-time PCR: prinsipp for kvantitering Mye templat Instrumentet genererer en lineær standard kurve som gir sammenhengen mellom utgangsmengder templat og antall PCR-sykler Mindre templat Standard curve Formula for compared reactions Med en serie av kjente mengder input, lages en standardkurve som ukjente prøver kan kvantiteres utfra. n linear Noiseband = log N0 + n log2 Starting amount (known or estimated) # cycles at cross-point (measured) Log N0