Metodesammenligning av 3 automatiserte 25-OH-vitamin D immunoassays, mot hverandre og mot LC-MS/MS Nada Rakovan 1, Trine Lauritzen 1, Per Olov Nordström 1, Øyvind Skadberg 2 1 Avdeling for medisinsk biokjemi, Vestre Viken HF 2 Avdeling for medisinsk biokjemi, Stavanger Universitetssykehus

25-OH-vitamin D-konsentrasjonen i serum er et mål på organismens vitamin D-lager - for de fleste formål tilstrekkelig for å vurdere en persons vitamin D-status 1,25-(OH)2-vitamin D-konsentrasjonen i serum reflekterer kalsiumbalansen - er mest relevant der man mistenker nedsatt produksjon (nyresvikt) eller økt produksjon (sarkoidose og lymfom)

Metoder for måling av vitamin D LC-MS/MS (væskekromatografi-tandemmassespektrometri) Immunoassay HPLC (high performance liquid chromatography)

Metabolitt LC-MS/MS Immunoassay 25-OH-vitamin D3 Måles Måles, kan ha nedsatt gjenfinning 3-epi-25-OH-vitamin D3 Måles, kan interferere i analysen Måles ikke 24,25-(OH)2-vitamin D3 Måles, interferer i analysen Dahl SR, Thorsby PM. Hvordan måle vitamin D-status? Tidsskr Nor Legeforen 2014; 134:729 – 31.

Litt om analyseprinsippene Immunoassaymetoden er basert på en immunologisk reaksjon mellom antigen (analytt) og et antistoff kan gi kryssreaksjoner mellom antistoffet og andre komponenter i prøven LC-MS/MS-analysen er en direkte kjemisk måling av analyttkonsentrasjonen på bakgrunn av ladning og masse Metoden er basert på en separasjon av analyttene på en kolonne, etterfulgt av deteksjon ved hjelp av massespektrometri (måling av molekylvekt)

Måling av vitamin D Vestre Viken HF per i dag Seksjon Instrument fra Metode Årlig antall analyser Bærum Siemens (ADVIA Centaur ®) Enzymatisk 24 588 Drammen Abbott (ARCHITECT) 45 364 Ringerike Roche (Cobas) 7 610 Kongsberg 11 501

Metoder Totalt 113 humane serumprøver av forskjellige nivåer ble analysert (5,9-300,5 nmol/L) Serum analysert på automatiserte immunoassays: Abbott (ARCHITECT i2000 25-OH vitamin D) Siemens (ADVIA Centaur ® Vitamin D Total analyse) Roche (Cobas 6000 Vitamin D) Resultatene ble sammenlignet mot hverandre og mot en LC-MS/MS (SUS), som referansemetode

Grensen for outliers (nmol/l) Resultater Metode N Gjennomsnitt (nmol/l) SD Median (min.-maks.) LC-MS/MS 113 57,24 ±41,45 53,90 5,94 - 209,08 ARCHITECT 71,61 ±55,72 64,00 14,70 - 300,50 ADVIA Centaur ® 108 60,35 ±40,30 53,00 11,00 - 253,00 Cobas 105 61,69 ±43,66 56,20 7,76 - 168,90 Metode N Grensen for outliers (nmol/l) Antall outliers % outliers LC-MS/MS 113 >163 5 4,4 ARCHITECT >165 9 8,0 ADVIA Centaur ® 108 >126 10 9,3 Cobas 105 >168

Gjennomsnitt og 2xSD

Box plot

Immunoassay vs. LC-MS/MS Korrelasjoner Immunoassay vs. LC-MS/MS Korrelasjon ccc * N r ρc 95% KI ARCHITECT 113 0,911 ¤ 0.837 0.785 til 0.877 * ADVIA Centaur® 108 0,890 ¤ 0.880 0.831 til 0.915 * Cobas 105 0,893 ¤ 0.861 0.809 til 0.900 * ¤ Spearman korrelasjon - alle korrelasjoner er signifikant (p<0,001) * ccc - konkordans korrelasjonskoeffisient alle er signifikante og korrelasjoner er svake

Spearman korrelasjon LC-MS/MS Beste Spearman korrelasjon koeficient er hos Architekt 45° vinkel Beste konkordance korrelasjon koeficient (45° vinkel) er hos Advia LC-MS/MS

Passing-Bablok regresjon Immunoassay vs. LC-MS/MS Passing-Bablok regresjon ¤ N Slope 95% KI Intercept ARCHITECT 113 1,19 1,09 til 1,28 2,09 -1,07 til 6,15* ADVIA Centaur® 108 0,88 0,83 til 0,94 5,82 3,08 til 8,43 Cobas 105 1,26 1,16 til 1,38 -6,35 -12,34 til -3,52 * ikke signifikant ¤ alle har ikke signifikant avvik fra linearitet (CUSUM test)

ARCHITECT vs. LC-MS/MS Passing-Bablok regresjon Intercept: 2,09 (ikke signifikant) Slope: 1,19 LC - MS/MS

ADVIA Centaur® vs. LC-MS/MS Passing-Bablok regresjon Intercept: 5,82 Slope: 0,88 LC - MS/MS

Cobas vs . LC-MS/MS Passing-Bablok regresjon Intercept: -6,35 Slope: 1,26 LC - MS/MS

Bland ‐ Altman differanseplott Immunoassay vs. LC-MS/MS N BIAS (Gjennomsnitt av alle forskjeller) -1,96 SD til 1,96 SD BIAS (%) -1,96 SD til 1,96 SD (%) ARCHITECT 113 14,4 -34,2 til 62,9 24,9 -35,1 til 84,9 ADVIA Centaur® 108 2,4 -39,0 til 43,8 6,9 -53,9 til 67,7 Cobas 105 6,8 -32,3 til 45,9 4,8 -51,9 til 61,5 Immunoassay vs. LC-MS/MS N Minimal forskjell Maksimal forskjell Median i forskjell ARCHITECT 113 0,10 134,3 10,6 ADVIA Centaur® 108 0,01 132,9 7,3 Cobas 105 0,03 74,7 7,2

ARCHITECT vs. LC-MS/MS Bland ‐ Altman differanseplott

ARCHITECT vs. LC-MS/MS Bland ‐ Altman differanseplott (%)

ADVIA Centaur® vs. LC-MS/MS Bland ‐ Altman differanseplott

ADVIA Centaur® vs. LC-MS/MS Bland ‐ Altman differanseplott (%)

Cobas vs . LC-MS/MS Bland ‐ Altman differanseplott

Cobas vs . LC-MS/MS Bland ‐ Altman differanseplott (%)

Sammenligning av histogrammer

Immunoassay vs. Immunoassay Passing-Bablok regresjon • Resultater Immunoassay vs. Immunoassay Korrelasjon¤ Passing-Bablok regresjon • N r¥ Slope 95% KI Intercept ARCHITECT vs. ADVIA Centaur® 108 0,90 1,34 1,23 til 1,46 -5,31 -11,55 til 0,21* ADVIA Centaur® vs. Cobas 100 0.85 1,57 1,38 til 1,78 -22,08 -32,72 til 12,98 * ARCHITECT vs. Cobas 105 0.87 1,06 0,97 til 1,19 * -11,66 -18,34 til -6,65 * ikke signifikant ¥ alle korrelasjoner er signifikant (p<0,001) ¤ Spearman korrelasjon • alle har ikke signifikant avvik fra linearitet (CUSUM test)

Resultater Immunoassay vs. LC-MS/MS N Falsk positiv (n=5)* Under 50 nmol/l Immunoassay vs. LC-MS/MS N Falsk positiv (n=5)* Falsk negativ (n=7)¤ Sensitivitet Spesifisitet ARCHITECT 113 1 4 97,92% 93,85% ADVIA Centaur ® 111 5 2 90,57% 96,55% Cobas 98,04% 98,39% * Falskt positivt resultat: lik eller under 50 nmol/l ved immunoassay og positivt over 50 nmol/l ved LC-MS/MS ¤ Falskt negativt resultat: over 50 nmol/l ved immunoassay og negativt lik eller under 50 nmol/l ved LC-MS/MS

Falsk positive resultater

Falsk negative resultater

Enkelte prøver med D2 LC-MS/MS (D2+D3) (D2) ARCHITECT ADVIA Centaur ® Cobas 65,07 8,52 78,3 54 78,65 115,11 107,80 77,8 248 69,76 209,08 118,28 179,4 253 >175

Sammendrag av resultater Immunoassays vs. LC-MS/MS: Advia har de fleste outliers Architect har den beste Spearman korrelasjonen (0,911) Advia har den beste ccc (ρc=0.880), men svak Advia har det beste slope (0,88) (Passing-Bablok regresjon) Architect har bare proporsjonal forskjell (Passing-Bablok regresjon) Best BIAS (2,4) har Advia men prosentvis (6,8 %) har Cobas Det verste BIAS (24,9 %) prosentvis har Architect Cobas har den beste sensitiviteten (98,04%) og spesifisiteten (98,39%) for å påvise vitamin D-mangel Immunoassay vs. immunoassay: største forskjellen i regresjonsanalyse var mellom Advia vs. Cobas (y= –22,08 + 1,57x)

Konklusjon Vi observerte metode variasjoner mellom de ulike 25-OH-D-assays Spesielt for enkeltprøver var det merkbare/store forskjeller (opp til 134 nmol/L) Alle immunoassays overestimerte (mest Architect: bias=24,9 %) I et rutine laboratorium er alle tre immunoassays og LC-MS/MS metoder brukbare til å måle 25-OH-vitamin D, forutsatt at disse metodene er riktig standardisert og laboratoriet deltar i EKV program med oppgitt referanseverdi slik at evt påvist metodebias kan faktoriseres Det er viktig å informere klinikerne om disse metodeforskjellene som kan ha direkte innvirkning på tolkningen av resultatene, og at pasienter følges med prøver tatt på samme analysemetode/ laboratorium