Transkripsjon i eukaryoter Voet & Voet kapittel 33 + litt supplement Lagt på nett: http://folk.uio.no/oddsg/

Oversikt RNA polymerase I RNA polymerase III RNA polymerase II proteinfaktorer og promoter/gen-organisering RNA polymerase III RNA polymerase II Kromatin som medspiller 80% av total RNA syntese fra disse ”Oddpols”

RNA polymerase I (RNAPI)

Klasse I gener (rRNA) transkribert av RNA polymerase I (RNAPI) RNAPI syntetiserer kun en type RNA: ribosomalt RNA En trx enhet (7.5 kB) Multiple tandem gener for å øke rRNA produksjonen 50 - 10 000x avh av species

Nucleoli RNAPI lokalisert til nucleoli (ribosom-fabrikker)

Klasse I gener (rRNA): promoter-organisering Repeterte gener med promotere imellom Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter Core UPE Terminator elementer Enhancere

Klasse I gener (rRNA): Hjelpefaktorer involvert Repeterte gener med promotere imellom Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter UBF UBF SL1 TTF-1 RNAPI Core UPE Terminator elementer Enhancere

RNA polymerase III (RNAPIII)

Klasse III gener transkribert av RNA polymerase III RNAPIII syntetiserer et fåtall ulike RNA som er små, stabile og ikke-translaterte tRNA, 5S RNA, 7SL RNA, U6 snRNA ++

Promotere - tre typer Typer promotere Type I: som i 5S rRNA genet, A-I-C blokker Type II: som i tRNA genene, A+B blokker Type III: atypiske uten intrageniske elementer A I C +1 +50 +64 +80 +97 +120 A B +1 +8 +19 +52 +62 +73

Klasse III gener transkribert av RNA polymerase III Promotere med intrageniske elementer Mutasjoner endrer både promoter og produkt Polymerasen må lese igjennom aktiverende trx-komplekser A-blokk B-blokk

Klasse III gener: hjelpefaktorer involvert Type II promotere - mest klassiske Sekvens: TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC A B TFIIIB TBP

Klasse III gener: hjelpefaktorer involvert Type I promotere en type gen, en spesial faktor TFIIIA Sekvens: TFIIIA - TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC TFIIIA A I C TFIIIB TBP

RNA polymerase II (RNAPII)

Understanding transcription - Increasing complexity 80ties 70ties 90ties Today Lemon and Tjian 2000 Genes Dev. 14:2551-69

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II Mediator Signal RD RNAPII TF TAD TFIID DBD Transcription factors TBP Chromatin GTFs TATA Enhancer Promoter Nucleosomal template - chromatin modifying activities

Språket: cis-elementene

cis-elementenes funksjon = Templater for kompleksdannelse The function of cis-elements is being templates for the assembly of multiprotein complexes

Promoter organisering core promoter upstream regulatoriske element Enhancere Boundary elements LCR - locus control regions Promoter organisering

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II Subklasser RNAPII-promotere mRNA-kodende TATA+ INR+ både TATA og INR uten TATA, uten INR snRNA-kodende

Noen typer cis-elementer UPE - Upstream promoter elementer Binder konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler Lokalisert nær TATA/INR (innen ca. 200 bp) Eksempler CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) GC-rike bokser - binder Sp1 Regulatoriske elementer 1. Responsive elementer eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heast shock, glucocorticoider 2. Celletype spesifikke elementer Lokalisert innblandet med UPE

Enhancere Distale elementer - Enhancere Øker kraftig aktiviteten av en promoter virker over lang avstand, uavh. av orientering, upstream/downstream Drosophila wing margin enhancer: 85 kb upstream TSS Immunoglobulin Hm enhancer: i 2. Intron T-cell receptor a-chain enhancer: 69 kb downstream samme cis-elementer som proksimalt multiple cis-elementer innen et lite område (50 bp - 1.5 kb) cis-elementer for mange ulike faktorer responsive/vevsspes avh av sammensetning

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

RNA polymerase II Core med aktivt sete RPB1 (´-like)binder DNA  Prokaryot  RNA polymerase II  ´  Eukaryot DNA-bindende Core med aktivt sete RPB1 (´-like)binder DNA RPB2 (-like) binder NTP RPB3 (-like) assembly factor Felles subenheter RPB5, 6 og 8 felles for RNAPI-III Til forskjell fra prokaryot RNAP, er RNAPII ikke i stand til spesifikk promoter-gjenkjenning NTP-binding

CTD - ”C-terminal domain” Hale på største subenhet: (YSPTSPS)n n = 26 i gjær, 52 human pol.II hydrofil eksponert hale Unik for RNAPII Essensiell funksjon in vivo  >50% letalt

CTD- funksjon Fosforylering: (YSPTSPS)n Reversibel fosforylering på både Ser og Tyr Fosforylering endres gjennom trx syklus Kinasering skjer etter PIC assembly defosforylering av fri pol eller ved terminering

Fosforylerings-syklus

CTD funksjon Initiering Promoter clearance Elongering Rolle i “recruitment” av RNAPII til promoter bare ufosforylert pol deltar i PIC-assembly Promoter clearance RNAPII går over i hyperfosforylert elongeringsmodus CTD fosforylering bryter interaksjoner og RNAPII frikobles fra PIC Elongering Samtidig: CTD fosforylering danner nye interaksjoner med elongeringsfaktorer En rekke nye CTD-bindende proteiner identifisert siste år med funksjoner i splicing og terminering Tett kobling: transkripsjon - pre-mRNA prosessering

CTD binder også en rekke faktorer Holoenzym = Mediator + core RNAPII Mediator RNA processering RNAPII = ”mRNA factory” som utfører koblet transkripsjon, capping, splicing og prosessering av 3´-ende

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

GTFs - generelle transkripsjonsfaktorer Hjelpefaktorer som dirigerer RNAPII til promoter Trinnvis assembly Dannelse av PIC - pre-initiation complex

1. Trinn: TATA bindes av TBP TBP binder TATA - sekvensgjenkjenning minor groove kontakt TBP binder også en rekke andre polypeptider aktivatorer TAFs (kalles da TFIID = TBP + TAFs) GTFs (TFIIB, TFIIA) TBP = universell TF involvert i alle 3 tr.systemene TBP i SL1, TFIID, TFIIIB protein DNA

TBP = sadel (med TATA som hest) 3D: Sadel-struktur Konkav innerside binder DNA i minor groove via 10-stranded antiparallelt b-sheet Konveks overside binder prot via 4 a-helikser stigbøyler (“stirrup”) på hver ende

TBP bøyer DNA (stakkars hest) Ikke slik, …….men slik

RNA polymerasen gjenkjenner en GTF-bundet promoter TBP TFIIA TFIIB Dette protein-promoter komplekset er det som gjenkjennes av RNAPII

PIC ”modnes” etter RNAPII binding TFIIH: multisubenhet med CTD-kinase + helicase for smelting

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

PIC-dannelse stimuleres av transkripsjonsfaktorer Dannelse av PIC styres av TFs som binder elementer oppstrøms Aktivatorer med høy sekvens-spesifisitet Rekrutteringspunkt for assembly av komplekser

(Oppstrøms) Transkripsjonsfaktoer TAD DBD N C Modulær oppbygning - iallfall 2 domener: 1. DBD - DNA-bindingsdomene 2. TAD - transaktivatordomene DBD: grunnlaget for gruppering i TF-familier Sinkfingre, kjernereseptorer, helix-loop-helix, leucin-zippere,osv. TAD ulike grupper Tre klasser med ulike targets sure domener (GAL4, steroid receptor) glutamin-rike domener (Sp1) prolin-rike domener (CTF/NF1) Strukturløse i fri tilstand - 3D i kontakt med target?

Mange ulike TFs Konstitutive TFs Regulatoriske TFs Konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler Binder cis-elementer lokalisert nær TATA/INR Eksempler CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) GC-rike bokser - binder Sp1 Regulatoriske TFs 1. Signal-responsive faktorer eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heat shock, glucocorticoider 2. Celletype spesifikke faktorer

Konstitutive Sp1 binder GC-bokser Noen eksempler

Synergi - mange faktorer stimulerer bedre enn én alene Mange kontakter gir mer effektiv PIC assembly

Familier - oppdelt etter DBD struktur Zinc finger bHelix-Loop-Helix (Max) STAT dimer Leucine zipper (Gcn4p) p53 DBD NFkB

Familie Sinkfinger proteiner TFIIIA fra Xenopus var første isolerte og klonede eukaryote TF Funksjon: aktivering av 5S RNA transkripsjon Primærstruktur TFIIIA Bygget opp som repetisjon 9x 30 aa minidomener + 70 aa unik region C-term Hvert minidomene konservert mønster av 2Cys+2His Hvert minidomene strukturert rundt et koordinert sink ion

Sinkfinger proteiner Sink koordineres av 2 Cys + 2 His Antall fingre varierer: 2-37 Antall medlemmer uvanlig mange S.cerevisiae genomet: 147 C.elegans genomet 535 Flere hundre humane Zif gener

3D struktur av sinkfingre Zif268 - første multi-finger struktur Hver finger et minidomene med -struktur major groove kontakt via -heliks i  gjenkjenning av base tripletter

Kjerne-reseptorer - en sinkfinger-variant To ”sinkefingre” utgjør en samlet enhet En finger kontakter DNA Dimeriserer ved binding til DNA

Kjernereseptorer Stor familie hvor DBD binder 2 Zn++ via tetraedrisk mønster av Cys Konservert DBD 70-80 aa Medierer transkripsjonell respons på komplekse ekstracellulære signal klassiske steroid hormoner sekretert fra endokrine celler  via blod  målcelle  diffusjon inn  binder reseptor  aktiveres  modulerer målgener Evolusjonsmessig koblet til multicell.org

Gal4p - enda en sinkfinger variant (6 Cys + 2 Zn)

Leucin zipper - nesten glidelås 60-80 aa motiv funnet i en rekke dimere TFs Prototypiske eks.: GCN4, Fos, Jun, C/EBP, ATF, CREB mange mulige dimer-partnere gir tallrike kombinasjoner Dimer-dannelse via parallell coiled coil av a-helikser (ZIP) Hver 7.aa = Leu 3.5 aa pr turn (coiled coil) hver 7.aa lik posisjon Alle Leu samme side og dimerisering via “leucine zipper”

Leucin zipper - nesten glidelås Dimer via parallell coiled coil av a-helikser Hver 7.aa = Leu 3.5 aa pr turn (coiled coil) hver 7.aa lik posisjon Alle Leu samme side og dimerisering via “leucine zipper”

Kontakter DNA som en pinsett

HLH - helix-loop-helix - lignende variant med brutte helikser

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

Koaktivatorer - brobyggere som også gir kromatin remodelering remodellering

En rekke coaktivatorer og corepressorer deltar

Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

Kromatin Kromatin - et nukleoprotein kompleks bevirker kondensasjon og organisering av DNA protein:DNA = 2:1 masseforhold histon:DNA = 1:1 masseforhold ulike kondensasjonsgrader 10 nm utstrakt fiber med nukleosom-perler (7x compaction) 30 nm kondensert fiber (40-50x compaction)

Grunnenhet - nukleosomer Repetert enhet i kromatin Repeat lengde: 180-210 bp Nuklease fordøying litt m.nuklease: oligo-nukleosomer mer m.nuklease: kromatosom m/ 166bp DNA + octamer + H1 enda mer m.nuklease: core partikkel 146 bp DNA + octamer DNA venstredreid superheliks 2 turns rundt

Nukleosomene består av histoner Fem klasser histoner H2A H2B H3 H4 H1 Basiske proteiner Lignende 3D fold

Histoner - ekstremt konserverte Kalver eller erter - nesten det samme

Oktamer partikkel Octamer = (H2A, H2B, H3 og H4)2 Assembly: H3-H4 tetramer  +2 H2A-H2B dimere Krystallstruktur (low resolution 1984, high resolution 1997) C-terminal: globulær mens N-terminal: ustrukturerte fleksible haler (tails) basiske haler antas inngå i DNA-kontakt basiske haler involvert i internukleosom interaksjon sete for posttranslasjonell modifisering (acetylering)

DNA kveiles rundt på utsiden

3D struktur av nukleosomer

H1 ved inngang/utgang H1 linker histon assosisert med linker DNA mellom nukleosomer (ca. 1 stk H1 pr nukleosom) binder DNA entry/exit fremmer folding 10nm  30 nm fiber repressiv effekt på transkripsjon

H1 bidrar til videre pakking

Høy pakkegrad Nukleosomer - 7x H1-mediert 300Å filament - 40x Videre pakket opp til 8000x

Flere nivå av pakking 2 m DNA er i kjernen pakket ned til en diameter på 5 - 10 mm.

Hvordan påvirker kromatin transkripsjon? .. som repressor Chromatin maintains a restrictive ground state by blocking association between Pol II basic transcription machinery and DNA while permitting many activators to bind to their target sites. TFIID TBP Activator

Transkripsjonsfaktorer fremmer PIC dannelse + åpning av kromatin Enzymes that covalently modify the nucleosomal histones ATP-dependent chromosomal- modifying enzyme

To måter å åpne kromatin på 1. Åpning av kromatin via dirigert acetylering Histon-modifisering via HAT aktivitet 2. Åpning av kromatin via dirigert nukleosom mobilisering ATP-avhengig prosess

Halene på histonene modifiseres som signaler til transkripsjon Acetylation Methylation Phosphorylation Ubiquitination ADP-ribosylation

Topologi Selv åpnet kromatin er en topologisk utfordring for RNAPII