KJB400 forelesning Voet & Voet Kapittel 29 + 33 RNA processering KJB400 forelesning Voet & Voet Kapittel 29 + 33

Kobling trx-trl Koblet translasjon /transkripsjon i prokaryoter Adskilt i eukaryoter

Tre typer endringer Spalting, fjerning av sekvenser Exo- eller endo-nukleolytisk spalting Splicing Påsetting av nukleotid(er) 5´-ende og 3´-ende Modifikasjon av spesifikke nukleotider

Tre grupper RNA å modifisere Pre-mRNA Påsetting Splicing Ribosomal RNA Spalting tRNA Modifikasjon

Pre-mRNA prosessering Prokaryoter: primær transkript = mRNA Eukaryoter: transkripsjon/ translasjon adskilt, mRNA modifisert i kjernen før translasjon i cytosol

Transkripsjon - prosessering cap AAAAAAAAAAAAA Pre-mRNA (hnRNA) mRNA Koblede prosesser

Påsetting i 5´-ende: capping Cap: 3 modifikasjoner 7-met-guanosin koblet til 5´-ende Kobling via 5´-5´trifosfat bro Skjer kotranskripsjonelt O2´-metylering av ribose Cap2, Cap1 (multicellulær), Cap0 (unicellulær) N6-metylering av adenine Cap-1 Cap-2

Enzymer involvert Capping skjer når RNA bare er 25-30 baser lang - altså kotranskripsjonelt cap bindes til et ”Cap binding complex” CBC CBC stimulerer splicing og 3´-end prosessering 3 enzymer involvert 1.Trifosfatase fjerner et fosfat 2. Guanylyl transferase kobler på GMP 3. 7-metyltransferase modifiserer terminal guanosin Fosforylert CTD rekrutterer capping enzym

Modifisering av 3´- ende: poly-adenylering Definert 3´-ende dannes ikke via terminering, men via prosessering Pre-mRNA heterogene 3´-ende, mRNA veldefinert 3´-ende Poly(A) haler påsettes i 3´-ende 20-50x A-strekk i en egen prosess dvs poly(A) ikke gen-kodet AAAAAAAAAAAAA cap

Trimming av 3´-ende cap Upresis terminering Presis ende via Presis ende via Spalting og polyadenylering AAAAAAAAAAAAA cap

Poly-adenylering - to-trinns prosess Spalting 15-25 nedenfor AAUAAA Innen 50 nt før en mindre konservert (G)U-rik Poly(A) hale lages av poly(A) polymerase Koblet: AAUAAA binder CPSF Cleavage and polyadenylation specificity factor Bundet CPSF stimuleres poly(A) polymerase

Kotranskripsjonell prosessering

Prosessering i 3´-ende: Kotranskripsjonelle prosesser Når RNAPII nærmer seg 3´-enden av transkriptet, skjer flere koblede prosesser Splicing av terminalt intron spalting ved poly(A)-site, påkobling av poly(A) hale, terminering nedstrøms for poly(A)-site og frigjøring av RNAPII Disse prosesser avhenger av CTD ”Cleavage-polyadenylation specificity factor” CPSF og ”cleavage stimulation factor” CstF binder spesifikt til CTD og finnes assosiert med holoRNAPII.

Hvorfor poly(A)? Klippekort-hypotesen PABP AAAAAAAAAAAAA Poly(A) beskytter mRNA mot degradering i cytosol Poly(A) bindes til PABP Poly(A) forkortes ettersom mRNA translateres cap AAAAAAAAAA cap AAAAAAA cap AAAA cap A cap ustabil

Splicing Kodende sekvens er i eukaryoter oftest stykket opp avbrutt av ikke-kodende regioner Heterogen nukleær RNA hnRNA 2 - 20 kb Større en protein skulle tilsi Rask turnover 1977: pre-mRNA har introns Som blir fjernet ved splicing

Eksempel: ovalbumin Presisjon - leseramme beholdes Rekkefølge av exons beholdes Introns er som oftest større enn exons

Et typisk humant gen

Sekvens-signaler som definerer introns Invariant GU i 5´-splice site (5´ss) Invariant AG i 3´- splice site (3´ss) Branch point sequence (BPS) Polypyrimidine tract (Py tract) Poly-Y tract Likevel så degenert at dataprogram bare klarer 50% treff i prediksjon

Mekanisme:via 2 transesteri-fiseringer Trinn 1 - dannelse av lasso-struktur (lariat) Exon-intron (5´) brudd og exon release Bro 2´-5´-fosfodiester A i forgrening: CURAY konsensus 20-50 foran 3´-splice site

2´-5´-fosfodiester forgrening

Mekanisme:via 2 transesteri-fiseringer Trinn 2 - fusjon av exoner Fri 3´-OH fra exon N danner fosfodiester binding med 5´-fosfat i exon (N+1) Avspaltet lariat-intron blir raskt degradert Uten fri energi input

”Snurps” Hvert signal binder en snRNP Small nuclear RNAs snRNAs binder protein og danner: Small nuclear ribonucleoproteins Disse gjenkjenner ulike splice-signaler, noen via base-paring

Spliceosomet utfører splicing Spliceosomet = 5 snRNPs + prot = 50-60S U1, U2, U4, U5 og U6 snRNPs Mange andre non-snRNP proteiner Trinnvis assembly 5´ss bindes av U1 snRNP (E kompleks) Poly-Y + 3´ss bindes av U2AF Forgrenings-A bindes av U2 snRNP ATP-avhengig trinn U4/U6-U5 tri-snRNP assosieres og et kompetent splice kompleks dannes

Bro-dannelse: over exon og over intron SR-proteiner involvert

Fortsatt mye ukjent

Hvorfor splicing? Genetiske fossiler eller … ….nyttig mekanisme?

Nytte: Alternativ splicing En måte å øke protein diversitet uten å øke antall gener Drosophila Dscam genet genererer 38016 isoformer 576 alternativt splicede former av K+-kanal i fugleøre-reseptorer (rolle i gjenkjenning av lyd-frekvenser) Genom sml Humane genom bare 30-40 000 gener Mer alternative splicing enn i lavere organism 3.2 alternative splice -former pr humant gen 1.34 alternative former pr gen i C.elegans

Eksempel: a-tropomyosin 7 Celletype-spesifikke varianter

Mange måter å variere på Alternative 5´-splice sites (a) Alternative 3´-splice sites (b) Exon skipping/inclusion © Alternativ exon bruk (d) Intron retensjon (e)

Alternative initieringsseter (alternative 1. Exons) Alternative 1. Exons ≈ altern promotere Hvor separat regulering/nivå er nødvendig -amylase

Sykdommer pga splicing Mange genetiske sykdommer skyldes feil splicing 15% av genetiske sykdommer er forårsaket av mutasjoner som ødelegger funksjonelle splicingsseter eller genererer falske nye

Exons ≈ proteindomener ? W.Gilbert: exons svarer til primitive protein-domener som større proteiner er satt sammen av Eks. Pyruvat kinase

Evolusjonshypoteser: ”Intron early” eller ”Intron late” Var der tidlig og er forsvunnet i prokaryoter Intron late Intron er blitt satt inn i intron-frie ORFs

Prosessering av ribosomal RNA

E.coli pre-rRNA prosessering Endo- og exo-nukleaser

RNaser Endonukleaser: RNase III, RNase P, RNase E og F Spalting i baseparede stems Exonukleaser: M16, M23 og M5 trimmer ferdig

rRNA er metylert N6,N6-dimetyl-adenin O2´-metylribose Funksjon ukjent Beskyttende mot nukleaser som benytter 2´-OH

Eukaryot rRNA prosessering ligner den hos prokaryoter Small nucleolar RNAs (snoRNA) involvert

Prosessering og assembly av ribosomer

Prosessering av tRNA

tRNA - kløverblad-struktur Mange baser er modifisert Antikodon 3´-CCA Kodet hos prokaryoter Appended hos eukaryoter via en tRNA nukleotidyltransferase

Splicing av tRNA introns Noen eukaryote tRNAs har mini-intron Ved siden av antikodon

tRNA trimmes i 5´-ende av et ribozyme: RNase P Rnase P = 377 nt RNA + 14 kD protein RNA katalytisk Protein (basisk) reduserer elektrostatisk frastøtning mellom ribozym og substrat