Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays) Ivo Nentwich IMTRA, Ahus

Immunometriske analyser (immunoassays) Subgruppe av immunologiske teknikker Spesifikk binding mellom antigen-spesifikt antistoff som er markert (“labelling”) Reaksjonen visualiseres vha målbart signal (enzym, radioaktiv, fluorescens, chemiluminiscens..) Signalet måles med tilsvarende deteksjonssystem

Immunometriske analyser (immunoassays) EIA - ELISA og modifikasjoner (Elia, ImmunoCap) Dot Blot, Line-blot, Western blot, multiplex immunoassays ELISPOT Radiometriske metoder (RIA, radiobinding assay, RAST) Immunfluorescens

Immunometriske metoder Generelt skjema for immunoanalyser

Immunoanalyse karakteristikker Kriterium  beskrivelse   1. Separasjonstrinn heterogen = med separasjonstrinn homogen = ingen separasjon 2. Separasjonsmetode Løsning eller væskefase Fast fase 3. Kjemi av binding Kompetitiv (markert+umarkert reag.) Samtidig tilsetning av reagenser Suksessiv tilsetning av reagenser Ikke-kompetitiv 4. Markering av reagens Antigen markert Antistoff markert 5. Type av markering Radioaktiv isotop [radionuklid: H3, C14, I125, S32…] Enzym: Horseradish peroxidase Alkaline phosphatase β-Galactosidase Fluorofor Luminofor Mange andre….. 6. Kalibreringsmodus Homolog standardkurve (antigen) heterolog referansekurve (antistoff)

Markeringssystemer Enzymer (HRP pepperrot peroxidase, AP…) Enzymer med fluorescent deteksjon (FEIA) Enzymer med kjemiluminiscens deteksjon (Immulite) Radioaktive isotoper (I125, S35, P32…) Fluorokromer – FITC, PE…. Gull, sølv..

Immunometriske teknikker for påvisning av antistoff (indirekt metode)

Påvisning av antigen (sandwich ELISA) Antistoff bundet på fast fase

Påvisning av antigen (sandwich ELISA)

ELISA - plate

ELISA, RIA – litt om histori RIA (Yalow, Berson 1960) Helsefarlig stråling Utvikle kobling mellom antistoff og enzym (Avrameas, Pierce) Utvikling av immunosorbent (Wide, Porath 1966) 1971 Perlmann, Engvall – SE, Schuurs – NL publiserte den nye EIA/ELISA

Phadia Elia Anti-IgG/A/M – enzymmarkert (beta-galaktosidase) Methylumberliferyl-B-D-galaktosid Stopping av enzymreaksjon Fluorescens-måling ved 445 nm

Dot blot Direkt påføring av antigen på nitrocellulose membran Preinkubasjon (blokkering) Inkubasjon med antistoff mot antigen vi leter etter (antigenpåvisning) Inkubasjon med pasientens serum Markert antistoff (enzym, radioaktiv…)

Dot blot Resultat Deteksjon – enzym, radioaktiv (film), kjemiluminiscens (film) 1 2 3 4 1 2 3 4

Line-blot Påvisning av antistoff Kjent renset antigen (oftest rekombinant) Inkubasjon med pas. serum Deteksjon – oftest enzym – kvantitativt, semikvanitativt, densitometri Radioaktiv, ECL (kjemiluminiscens)

Western blot - immunoblot Deteksjon av antistoff mot ukjente antigen/allergen SDS-PAGE med halv-tørr (semi-dry) blotting teknikk

Western blot - immunoblot Antigenene delt etter molekylvekt Inkubasjon med serum, vasking, antistoff Deteksjon kvalitativt, semikvantitativt eller kvantitativt (densitometri)

ELISPOT Produksjon av substanser på single-cell-level Mest til påvisning av cytokiner, antistoff

ELISPOT – modifikasjoner med fluorokromer

ELISPOT - resultat Typical Areas of ELISpot assays Characterization oh the TH1/TH2 response Vaccine Development Infectious diseases, i.e. HCV Therapy monitoring Epitope mapping Autoimmunity Transplantation

Radioimmunoassay RIA Klassisk metode Kompetitiv likvidfase analyse separasjontrinn

Radioimmunosorbent analyser Kompetitiv binding radioimmunoanalyse Non-kompetitiv immunoradiometrisk analyse Non-competitive (two-site) immunoradiometric assay (IRMA) Likner sandwich ELISA

RAST – klassisk etterfølger av RIA 1974 Pharmacia Sverige IgE antistoff mot allergener 1989 erstattet av ImmunoCap (CAP RAST, CAP Feia) Modifikasjon – paper radioimmunosorbent test PRIST – ikke routinemessig i bruk

Phadia ImmunoCap FEIA (fluoroenzymoimmunoassay) Spesifikk IgE testing – type I allergi

ImunoCap ISAC mikrochip Miniaturisert immunoassay platform muliggjør multianalyse av spesifikk antistoff IgE, IgG, IgG4 mot flere allergenkomponenter 20 μl of serum / plasma Rensede eller rekombinante allergenkomponenter på fast fase (biochip) Inkubasjon, vasking Fluorokrom-markert anti-humant IgE antistoff biochip scanner, software nødvendig semikvantitativ test: ISAC Standardized Units (ISU) Dyrt, semikvantitativt, vanskelig å interpretere, ikke fleksibelt – fast kombinasjon av 113 allergener

Analyser av multiple antistoff – multiplex immunoassay Polystyren mikrokuler impregnert med varierende proporsjoner av to ulike fluorokromer Familie av mikrokuler med unik fluorescens markering Koblet med antigen Inkubering, vask, markert antistoff Deteksjon – simultant hver mikrokul og bundet markert antistoff Brukes bl.a. til påvisning av antinukleære antistoff

Immunometriske metoder

Immufluorescens Direkte IF DIF (påvisning av bundet antigen i veven) Indirekte immunfluorescens IIF (påvsning av antistoff) Mikroskopisk preparat av celler/vev.. Inkubering med serum Vasking, anti-IgG-FITC Avlesing vha fluorescensmikroskop, titer rapporteres Eksempel: ANCA/ANA – multiblokk Indirect fluorescent antiboty test (IFAT)

Takk fra Ahus