Føtomaternell Blødning Diagnostikk Elzbieta Golebiowska Avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin, OUS Nasjonal blodbankkonferanse Oslo 23. – 25. September 2009

Indikasjoner Intrauterin fosterdød Neonatal anemi uten kjent årsak Mistanke om blødning av andre årsaker Mistanke om hemoglobinopatier Sigdcelleanemi og talassemi I Blodbanken i Oslo (BiO) utføres det 150-180 analyser per år

Hemoglobin hos foster Fetal hemoglobin (HbF) består av to alfa og to gamma kjeder. Foster hemoglobin binder oksygen med større affinitet enn voksen Hb, noe som gir bedre tilgang til oksygen fra mors blodbane. Etter fødsel slutter produksjon av HbF og mengden synker til normalt nivå for voksne mennesker (0 - 2% av total hemoglobin)

Kleihauer-Betke test Utredning ved mistanke om Føtomaternell blødning har i mange år vært basert på Kleihauer-Betke test, i bruk siden 1957 Testen tar utgangspunkt i at Hemoglobin F ikke så lett lar seg eluere slik som Hemoglobin A Ulemper Utstryket må være tynt, og farging må være riktig Tidskrevende Subjektivt, avlesning er avhengig av personale Større sannsynlighet for feilaktige lave verdier ved stor føtomaternell blødning ( konsekvensen er ikke tilskrekklig mengde av anti-D profylakse), feilaktige høye verdier, lett å forveksle føtale celler med små lymfocytter eller voksne celler som inneholder Hemoglobin F - F celler.

Bilde av utstryk med føtale celler Voksne celler

Bilde av utstryk med føtale og mange voksne celler med hemoglobin F- F celler

Flowcytometriske metoder Utredning med anti-D alene er ikke tatt i bruk i BiO fordi den er begrenset til Rh(D)negativ mor og Rh(D)pos barn Bare 15% av gravide kvinner er Rh(D) negative Anti-HbF kombinert med anti–D dekker rekvirentenes behov Etter utprøving av reagenser som fantes i 2003/2004, valgte vi reagenser fra Chemicon Metoden var validert i forhold til Kleihauer-Betke i 20 kunstige blandinger (mannlig giver + føtale celler fra navlestrengsblod) med meget bra overensstemmelse

Flowcytometriske metoder (fortsettelse) Prøvemateriale-EDTA blod Pasientprøver testes alltid sammen med kontroller Vi valgte å bruke hjemmelagede kontroller Cellene fikseres med 0,05% glutaraldehyd, permabiliseres med 0,1%Triton X–100 og farges med anti-HbF, eller både anti-D og anti-HbF Fetal hemoglobin (HbF) består av to alfa og to gamma kjeder. Det er gamma kjeder som farges med anti-HbF Referanseverdier for prosentandel celler som inneholder HbF (eget materiale) hos menn og ikke gravide kvinner er 0-0,17% Referanseverdier fra litteratur for voksne er 0 - 2%.noen oppgir verdier opp til 7% av erytrocytter

Føtomaternell blødning : mor Rh(D)neg foster Rh(D) pos Føtomaternell blødning er på ca 1.81% som tilsvarer ca 90ml (45 ml pakkede erytrocytter)

Føtomaternell blødning : mor Rh(D)neg foster Rh(D) pos En dose anti-D (1500 IE) nøytraliserer en føtomaternell blødning på ca 30 ml Rh(D) positivt blod. Ved verifisert føtomaternell blødning på mer enn 30 ml (15 ml pakkede blodceller), skal man gi økt dose anti-D immunglobulin. 1 dose ved anslått blødning <30 ml, 2 doser ved blødning mellom 30-50 ml, 3 doser ved blødning 50-75 ml osv. Veileder i fødselshjelp, Legeforeningen/ Norsk Gynekologisk Forening (2008), kapittel 18.1

Føtomaternell blødning : mor Rh(D)neg foster Rh(D) pos Volum av pakkede RBCs = % positive events x 1800 ml/100 x 122/100 1800 ml er antatt maternal RBC volum. For å "oversette" volum av pakkede RBC ganger man resultatet med 2 (for at det skal samsvare med fetal hematokrit på ca 51%). (Dziegiel MH et al. Transf Med 2006) Volum av pakkede RBCs = % positive events x 24 (vedlegg til IQ Products)

Føtomaternell blødning: anti-HbF Føtomaternall blødning på 0.21% Barn født med anemi pga Føtomaternall blødning

Flowcytometriske metoder (fortsettelse) Metoden er rask og reproduserbar Ulemper ikke tydelig nok separering mellom voksne erytrocytter som inneholder hemoglobin F(F celler) og føtale erytrocytter (gjelder mødre med mange F celler) Noen problemer med aggregater, muligens pga overfiksering Reagenser fra Chemicon oppfyller ikke krav om CE merking Metoden brukes fortsatt i rutinen, men behovet for en metode som gir bedre resultater og ”penere” plots gjorde at vi nå satser på nye reagenser fra IQ Products

Metoden baserer seg på farging av to intracellulære parametre Fetal Cell Count Kit Metoden baserer seg på farging av to intracellulære parametre Gamma-kjeder i fetal hemoglobin som farges med anti-HbF konjugert med PE Carbonic Anhydrase – enzym som finnes i alle voksne erytrocytter uavhengig av Hemoglobin type, som farges med anti-CA konjugert med FITC

Barn født med neonatal anemi HbF+/CA++(0.5%) HbF+ (4.42%) HbF-/CA++ Barn født med neonatal anemi

Neonatal anemi (fortsettelse)

Konklusjon Fetal Cell Count Kit fra IQ er CE merket Alle reagenser er inkludert Med testen kan man separere 3 forskjellige RBC populasjoner: voksne , fosterets og voksne F celler Metoden gir nøyaktig kvantifisering av fosterets celler Testen kan kombineres med anti-D ved behov (reagenser fra IBGRL er CE merket )

Takk!