RT-PCR og subcellulær lokalisering Bio4600

RT-PCR for å klone transkripter raskt for å undersøke exon-intron-overganger for å undersøke når og hvor et gen er uttrykt isolering av mRNA 1. tråd cDNA syntese med Revers Transkriptase PCR med genspesifikke primere

RT-PCR – rask kloning av transkripter isolering av mRNA revers transkripsjon innsetting i egnet vektor

Isolering av mRNA homogenisering av vev binding av oligo dT til polyA haler isolering ved hjelp av magnetisk kuler oligo dT som primer for revers transkriptase

RT-PCR – rask kloning av transkripter spesifikke primere egnet polymerase metode for å sette PCR-produkt inn i vektor

Tradisjonell kloning – bruk av restriksjonsenzymer og ligase Vi trenger enzymer med et egnet antall gjenkjenningsseter i fragmentet vi vil klone og i vektoren tid til kutting og ligering metoder til å selektere rekombinante plasmider

Nye kloningsmetoder enzymatisk rekombinasjon kortere tid mer effektiv seleksjon Topo-systemet (topoisomerase)

Kloning ved hjelp av topoisomerase topoisomeraseI fra Vaccinia virus kovalent bundet til en linearisert vektor med T-overheng I 3’-enden meget rask reaksjon

Subcellulær lokalisering subcellulær lokalisering forteller om proteinfunksjon metode for å se hvor proteinet er fusjonsprotein med Green Fluorescent Protein (GFP) egnete celler for å se proteinet

Subcellulær lokalisering sterkt konstitutive promoter (35S) løkceller partikkel bombardement

Nye kloningsmetoder enzymatisk rekobinasjon kortere tid mer effektiv seleksjon Gateway-teknologi (λ setespesifikk rekombiansjon)

Litt λ-biologi!

Litt λ-biologi DNA replication recombination head tail lysis LEFT ARM left end right end immediate early head tail lysis pE delayed early pL pM pO OL late OR delayed early late pR pR’ Nu1 A W B C Nu3 D E FI FII Z U V G T H M L K I J att int xis exo bet gam N cI cro cII O P Q S R LEFT ARM RIGHT ARM COS COS p – promoter O - operator

Sete-spesifikk rekombinasjon λ og E.coli att-seter har 15 bp felles kjerne-sekvens, men ulike flankeområder int og IHF er nødvendig for integrering int, xis og IHF er nødvendig for eksisjon

Gateway-kloning

Gateway-kloning effektiv rekombinasjon positiv og negativ seleksjon

Gener vi arbeider med IDA og IDA-like gener (IDL) koder trolig for liagander antas å være eksportert ut av cellen små gener uten intron

Gener vi arbeider med SET-domene gener proteiner involvert i kromatin-modulering SET-domene som modifiserer histon-haler