ATP og NADPH er kildene for fri engeri gor biosyntetiske reaksjoner

Struktur av ATP

ATP er gunstig plassert i energitabellen

“Energirike” fosforsyreanhydridbindinger

Koplede reaksjoner

Flere koplede reaksjoner

ATP som donor av grupper 1. Fosfatdonor ATP + glukose heksokinase glukose-6-fosfat + ADP 2. Pyrofosfatdonor ATP + ribose-5-fosfat fosforibosylpyrofosfat + AMP Ribosefosfat pyrofosfokinase 3. AMP-donor ATP + aminosyre aminoacyladenylat + PPi Aminoacyl-tRNA syntetase 4. Adenindonor ATP + metionin S-adenosylmetionin + PPi + Pi Metionin adenosyl transferase

Struktur av ATP

Overføring av fosfat fra ATP til glukose

Syntese av fosforibosylpyrofosfat (PRPP) PRPP inngår også i biosyntesen av pyrimidiner og av histidin og tryptofan. Enzymet aktiveres av PPi og 2,3-bisfosfoglycerat og inhiberes av ADP og GDP Ribosefosfat pyrofosfokinase Pyrofosfatgruppen i alfa-orientering

Dannelse av aminoacyladenylat

Generell prosedyre til bestemmelse av uorganisk fosfat Til 1 ml av en fosfatholdig løsning tilsettes 1,3 ml reagens A. Bland godt. Tilsett 0,5 ml reagens B. Bland godt med det samme. La prøvene stå ved værelsestemperatur i 45 minutter slik at den blå fargen utvikles. For å få mest mulig nøyaktige målinger er det viktig at denne tiden er lik for både standarder og ukjente prøver (bruk klokke). Dette skyldes at fargeintensiteten endres noe ved videre inkubering. Tilsett så 5 ml vann, bland godt og les absorpsjonen umiddelbart ved 660 nm i spektrofotometret. Reagens A: 2,5% Na2MoO4.2H2O i 1,25 M H2SO4. Reagens B: 1% metyl-p-aminofenolsulfat i 3% Na2S2O5. Fosfatanalysen beskrevet nedenfor skal utføres på prøvene i forsøkene 1, 2 og 3 samt standardprøvene. Bruk store reagensrør da alle prøver skal for­tynnes med 5 ml vann før lesing i spektrofotometret.

Standardkurve til fosfatbestemmelsen Fra en standard fosfatløsning (1 μmol/ml) utpipetteres 0 - 0,25 - 0,5 - 0,75 - Fra 1,0 ml i fem store reagensrør. Volumene justeres til 1 ml med vann. Utfør fosfatanalysen som beskrevet ovenfor. Gjem blindprøven da den skal brukes også i forsøk 1. Fosfat danner kompleksene H3(P(Mo3O10)4) og H3(PMo12O40) som reduseres av Na2S2O5 (2 NaHSO3 ÷ H2O) til en blanding av 5-verdig og 6-verdig molybdenoksid som danner kompleks med

Forsøk 1. Syrelabilt fosfat I 5 store reagensrør utpipetteres: 0,25 ml ATP-løsning 0,25 ml H2O 0,50 ml 2M HCl Rørene settes i kokende vannbad (med klinkekuler på toppen av rørene) og overføres deretter til et isbad etter henholdsvis 1, 2, 5, 10, og 15 min. Frigjort fosfat bestemmes som angitt i den generelle prosedyren. Avles prøvene i spektrofotometret mot blindprøven som ble laget til standardkurven. Lag en grafisk fremstilling av hydrolyseforløpet. Beregn konsentrasjonen av ATP i den utleverte løsningen ut fra maksimalt frigjort syrelabilt fosfat.

Forsøk 2 Totalfosfat I to oppslutningskolber pipetteres: Kolbe 1: 1,0 ml ATP-løsning + 0,25 ml 5 M H2SO4 Kolbe 2: 1,0 ml H2O + " (Blindprøve) Prøvene oppvarmes på elektrisk ovn i avtrekket i minst 30 minutter. Etter noen minutter utvikles hvite damper av SO2 (g) og SO3 (g) som tyder på at svovelsyren er maksimalt konsentrert. ATP vil nå etterhvert bli fullstendig dekomponert. Etter avkjøling overføres innholdet kvantitativt til hver sin 10 ml målesylinder vha. Pasteurpipette og destillert vann (skyll i hvert fall 5 ganger). Volumet justeres til 10 ml. Bland godt. Av disse løsningene utpipetteres 1,0 ml i duplikat til fosfatanalysen som utføres som beskrevet ovenfor. Ut fra totalfosfatbestemmelsen beregnes så konsentrasjonen av ATP i den utleverte løsningen. Sammenlign resultatet med det fra forsøk 1. Beregn forholdet mellom syrelabilt fosfat og totalfosfat.

Forsøk 3. Virkningen av heksokinase I syv rør pipetteres: 0,25 ml ATP 0,50 ml veronalbuffer Veronalbufferen inneholder glukose (substrat) og Mg2+ (kofaktor). Alle rørene settes i isbad: Rør 1 (Blindprøve for spektrofotometret) tilsettes 0,2 ml 5 M HCl, deretter 50 µl heksokinaseløsning som inneholder 2% glukose. Denne blindprøven korrigerer for forurensninger av fritt fosfat i blandingen og den skal derfor ikke kokes. Rør 2 (Nulltidsprøve) tilsettes først 0,2 ml 5 M HCl og deretter 50 µl heksokinaseløsning. Heksokinasen inaktiveres da med en gang (tid = 0). Rør 3, 4, 5, 6, og 7 settes i isbad og tilsettes 50 µl heksokinaseløsning. Rørene inkuberes ved 37 °C i h.h.v. 1, 2, 5, 10 og 15 min. Reaksjonen stoppes ved tilsetning av 0,2 ml 5 M HCl. Mengde syrelabilt fosfat skal bestemmes. Rør 2-7 (ikke rør 1) settes i kokende vannbad i 15 min. Etter avkjøling utføres fosfatanalysen som beskrevet over (alle rør). Beregn mengde syrelabilt fosfat og tegn reaksjonsforløpet på millimeterpapir. Hvordan stemmer resultatene med teorien?

Forsøk 4. Den molare absorbsjonskoeffisienten for ATP Du skal bestemme den molare absorbsjonskoeffisienten for selve ATP-molekylet (uten bruk av reagens A og B i fosfatanalysen). Pipettér 50 l ATP-løsning og 2,95 ml 0,1M HCl i et rent og tørt reagensrør. Mål absorbansen av prøven (tenk ut selv hvilken bølgelengde du bør måle ved, evt. diskuter med veileder). Beregn den molare absorbsjonskoeffisienten for ATP ved å benytte den konsentrasjonen som ble bestemt under Forsøk 1 og 2. (Den skal være ca 1,5 mM). Hvilken del av ATP-molekylet er det som absorberer elektromagnetisk stråling ved den valgte bølgelengde ? Neste uke skal dere gjøre laboppgaver med DNA. Hvilken bølgelengde tror du brukes til å måle absorbsjon/konsentrasjon av DNA og RNA ?

Aktiveringsenergi Arrhenius' ligning uttrykker sammenhengen mellom reaksjonshastighet og temperatur: (1) hvor k er hastighetskonstanten for reaksjonen, E er aktiveringsenergien og R er gasskonstanten. Ved integrering får en: (2) , eller (3) ; R er lik 8,3 J/mol x Kelvin når en forutsetter at E ikke varierer med temperaturen i det aktuelle området. A er en frekvensfaktor som representerer frekvensen av støt mellom reagerende molekyler. Ved å måle hastigheten av en enzymatisk reaksjon ved forskjellige temperaturer, kan en altså bestemme aktiveringsenergien ut fra ligning (2). For enzymer gjelder Arrhenius' ligning bare i et begrenset temperaturområde. Ved økende temperatur vil enzymets struktur forandres og til slutt denatureres. Når molekyler deltar i en kjemisk prosess, tenker en seg at de etter sammenstøt går via en overgangsform (eller flere) med høyere energi enn middelverdien for molekylene i reaksjonsblandingen. Bare noen av molekylene vil ha nok energi til å kunne danne en slik overgangsform ved sammenstøt, i mange tilfeller så få at reaksjonen ikke vil skje med målbar hastighet. Energiforskjellen mellom den midlere energi for sammenstøtende molekyler og energien for overgangsformen kalles aktiveringsenergien for reaksjonen. Aktiveringsenergien representerer en energetisk barriere for kjemiske reaksjoner. Kjennetegnet for enzymatiske (og andre katalyserte) reaksjoner er at aktiveringsenergien nedsettes når molekylene bindes til katalysatoren slik at en større del av molekylene vil være energirike nok til å reagere.

Regneoppgave Aktiveringsenergien for en gitt enzymatisk katalysert reaksjon er 25200 J/mol. Aktiveringsenergien for den tilsvarende ikke-katalyserte reaksjon er 84500 J/mol. Beregn forholdet mellom hastighetskonstantene for de to reaksjonene ved 37 °C. ATP er et molekyl som frigjør mye energi ved hydrolyse av høyenergifosfatbindingene. Til tross for dette er molekylet stabilt ved fysiologiske betingelser og hydrolyseres effektivt kun i nærvær av enzym. Forklar dette ut fra regneeksemplet ovenfor.

Standard Free Energies of Phosphate Hydrolysis of Some Compounds of Biological Interest