Utledning av den genetiske koden Crick & Brenner 1961: Genetisk analyse av baktierofag T4-mutanter: Kodoner er tripletter Nirenberg 1961: Polynukleotid fosforylase for syntese av polynukleotider. Poly(U) koder for poly-Phe. Nirenberg & Leder 1964: Trinukleotider stimulerer binding av aminoacyl-tRNA til ribosomer. Kodoner for de 20 aminosyrene Khorana: Syntese av repeterte polynukleotider. Den genetiske kode bekreftes. Stoppkodoner

Amino Acid Incorporation Stimulated by a Random Copolymer of U and G in Mole Ratio 0.76:0.24.

Aminoacyl-tRNA syntetaser Klasse I-motiver: HIGH og KMSKS, inngår i Rossman-folden Klasse II-motiver: Tre konserverte motiver som ligger i 7-trådet β-plate med tre flankerende helikser i kjernen av det katalytiske domene Klasse I må gjenkjenne antikodon, flere klasse II-enzymer interagerer ikke med antikodon. Klasse I aminoacylerer 2’OH i 3’ ende av tRNA, klasse II aminoacylerer 3’OH

tRNA-molekyl

Aminoacyl-tRNA

Hvilke tRNA-elementer gjenkjenner klasse I-syntetasen?

Viktige gjenkjenningselementer i fire tRNA

E. coli Gln-tRNA syntetase (klasse I) i kompleks med tRNAGln og ATP

Asp-tRNA syntetase (klasse II) fra gjær i kompleks med tRNAAsp og ATP

Forskjeller i tRNA-binding mellom klasse I- og klasse II-syntetaser

Plasseringen av tRNA og aminoacyladenylat på enzymet bestemmer hvilken OH-gruppe som blir aminoacylert

Noen aminoacyl-tRNA syntetaser har korrekturlesingsaktivitet

Det eukaryote ribosom Fakta fra E.coli 20000/bakterie 2500 kD 250Å diam. 70S (30S + 50S) 2/3 RNA + 1/3 protein 80% av E.coli RNA 10% av E.coli-protein proteinsyntese

Sammensetning av E. coli-ribosomer

Sammensetning av cytoplasmatiske ribosomer fra rottelever

Ribosomale proteiner, E. coli S1-S21 og L1-L31 Nummerert etter vandring i 2D gel S20 og L26 er felles for subenhetene, sitter i kontaktpunktet L7/L12 samme protein +/- (N-term.) acetylering, 4 eks ialt + L10 = L8 Alle andre proteiner i 1 eksemplar Minste: L34, 46 aa. Største: S1, 557 aa. Liten sekvenshomologi mellom de ribosomale proteiner (52) Mye Lys og Arg, lite aromatiske aa (rRNA polyanionisk) RNA-recognition motif (RRM) i 5 proteiner RRM: 3 antiparallelle b-sheets med a-heliks mellom 2. og 3.

Ribosomale proteiner og rRNA assosierer uten hjelp, ”self-assembling units” Start: S4, S8, S15, S17

Hva gjør proteinene og rRNA Small subunit- binding mRNA binding: S1,S3,S4,S5, S9,S12,S18 +3’-enden av 16S rRNA Antikodon binding i ”cleft” Gjenkjenner og binder tRNA Large subunit- katalyse Peptidyltransferase:L2,L11,L15L16, L18,L23,L27 + 23S rRNA GTPase-stalk: 4 stk L7/L12 Peptidyltransferase i ”valley” Membran assosiering: ved utgang av peptidkanal

Eukaryote vs. prokaryote Like i struktur og funksjon - ulike i nesten alle detaljer Varierende sekvens Eukaryote ribosomer er: Mye større, 80S 40S + 60S, struktur som prokaryoter Flere og større rRNA 40S: 18S rRNA 60S: 28S, 5,8S, 5S rRNA Flere proteiner Liten subenhet: 33 proteiner Stor subenhet: 49 proteiner

antikodonbinding Peptidyl- transferase Polypeptidutgang Kanal: 25 X 100-120Å Liten subenhet Stor subenhet

E. coli-ribosomet, 25Å oppløsning

Wobble-hypotesen 61 aminosyre-kodoner 31 +1 tRNA Mange tRNA binder flere kodon Wobble-hypotesen: de to første basepar binder stringent, mens det siste tillater non-Watson-Crick baseparring (U:G, I:A) Antikodon 3’ A----A----Gm 5’ antiparallell binding kodon 5’ U----U----C/U 5’ Gm (2’-metylguanosin) eller inosin er vanlig i antikodon

To ”wobble”-basepar, begge bekreftet ved strukturbestemmelse

Tillatte wobble-basepar

Puromycin sammenlignet med tyrosyl-tRNA

Foreslått mekanisme for ribosomal peptidsyntese

Modell av peptidyl transferase-senteret i ribosomet med substrat bundet til A- og til P-setet

Translasjonsinitiering hos E. coli IF-3 fremmer dissosiasjon av 70S-ribosomet. IF-1 stimulerer dissosiasjonen, kanskje ved å bidra til binding av IF-3 mRNA og IF-2 i ternært kompleks med GTP og fMet-tRNAfMet bindes til 30S IF-3 frigis. 50S bindes til 30S-initieringskomplekset. IF-2 hydrolyserer sitt GTP. Dette gir en konformasjonsendring i 30S, IF-1 og IF-2 frigis Non-ribosomale initieringsfaktorer deltar: IF-1, IF-2, IF-3 IF-3 binder til 30S subenhet => dissosiering IF-1 øker dissosieringshastigheten Kompleks av mRNA, IF-2, GTP og fMet-tRNAfMet binder 30S Denne tRNA-ribosom interaksjon krever ikke kodon-antikodon interaksjon IF-3 hjelper binding av mRNA til 30S IF-3 forlater 30S 50S binder til 30S => IF-2 hydrolyserer GTP => 30S konformasjonsendring => IF-1 og IF-2 dissosierer

Initiering -fMet Prokaryoter: fMet er første aa, metionin er formylert på NH2-gruppen Eukaryoter: AUG - prokaryoter: AUG, GUG fMet-tRNAfMet : samme syntetase for tRNAfMet og tRNAmMet Formylering skjer etter tRNA kopling Enzymet er spesifikt for Met-tRNAfMet N10-formyltetrahydrofolat er metyldonor fMet deformyleres eller fjernes helt post-translasjonelt

tRNAfMet, forskjeller sammenlignet med normalt tRNA

Translasjonsinitiering hos pattedyr: minner om prokaryot initiering, men mer komplisert

Initiering – prokaryoter vs. eukaryoter IF-1, IF-2, IF-3 fMet Shine-Delgarno sekvens Mono- and polycistronisk mRNA Proteinstart ved definert AUG Kan translatere sirkulært mRNA Eukaryot eIF-n, n>10 Ingen fMet Ingen Shine-Delgarno Monocistronisk mRNA Proteinstart = første AUG Kan ikke translatere sirkulær mRNA eIF-4E er cap-bindende protein, som hjelper 40S å starte scanning av mRNA

Ribosombindingssekvenser i prokaryot mRNA (Shine-Delgarno-sekvenser)

Forlengelsessyklus for E. coli-ribosomer (E-setet ikke vist)

Peptidforlengelse, skjematisk

Elongering - EF-Tu’s rolle Øker hastigheten i amino-tRNA binding - koster GTP Forlater aa-tRNA komplekset når det sitter i A-setet bundet til kodon på mRNA Utgjør 5% av E.coli protein, ca 100.000/bakterie ”Alle” aa-tRNA er bundet til EF-Tu/GTP EF-Tu/GDP regenereres: EF-Ts erstatter GDP og GTP erstatter EF-Ts Binder ikke tRNAfMet med Met eller fMet pga manglende basepar i aminoarmen

Regenerering av EF-Tu Tilhører familien av GTP-bindende proteiner Felles strukturelt motiv som: binder GTP/GDP hydrolyserer GTP Aktivitet avhengig av GTPase aktiverende protein (GAP) - for EF-Tu er det ribosomet. GTP hydrolyse => stor konformasjonsendring i EF-Tu guaninnukleotid-frigjøringsfaktor (GRF)- for EF-Tu er det EF-Ts

Elongering - 3-trinns syklus Binding (decoding), transpeptidering, translokasjon 40 aminosyrer inkorporert/sekund Ikkeribosomale elongeringsfaktorer:EF-Tu, EF-Ts, EF-G GTP hydrolyseres til GDP ved binding og translokasjon

Translokering - 2-trinns prosess Tom tRNA overføres til E-setet E P A Peptidyl-tRNA overføres fra A- til P-setet Non-ribosomal elongeringsfaktor: EF-G EF-G bindes i kompleks med GTP EF-G/GTP binding hindrer EF-Tu/GTP binding Fjerning av EF-G/GTP krever hydrolyse av GTP og er samtidig startsignal for binding av ny aa-tRNA i A-setet EF-G tilhører familien av GTP-bindende proteiner, men er sin egen GRF

Termineringsreaksjonen i E. coli-ribosomer RF-1 gjenkjenner UAA og UAG RF-2 gjenkjenner UAA og UGA Hos eukaryoter bindes en enkelt frigjøringsfaktor, eRF, til ribosomet sammen med GTP

Prokaryot vs. eukaryot Prokaryot Eukaryot RF-1, RF-2, RF-3(GTP) eRF(GTP)

Frigjøringsfaktorene ligner på tRNA men bindes ikke nødvendigvis til ribosomet på en måte som utnytter likheten…

Hva er GTP’s funksjon Hastighet Translasjon kan finne sted uten GTP - svært langsom IF-2/GTP, EF-Tu/GTP, EF-G/GTP, RF-3/GTP Ingen høy-energi intermediater Binding av GTP-bindende proteiner m/GTP til ribosomet => allosterisk forårsaket konformasjonsendring GTP => konformasjonsendring GDP + Pi => avslapning GTP hydrolysen er rask og irreversibel => tilknyttede reaksjoner blir det også

Hva er GTP’s funksjon Nøyaktighet Kinetisk feilsøking Binding skjelner mellom ”cognate” og ”non-cognate” kodon-antikodon interaksjon vha bindingsenergi GTP hydrolyseres, danner GDP intermediat med diss. konstant k3 Non-cognate k4 antas > cognate k4 Hvis k3>k4 => peptidbinding lages Hvis k4>k3 => ingen peptidbinding