Molekylærbiologiske metoder Ingrid Randen 2011

Utvalgte molekylærbiologiske metoder PCR (konvensjonell og ’real time’) SNP analyser Sekvensering RFLP Southern, Northern og Western blotting Plasmid og ekspresjonskloning FISH Mikromatriser RNA interferens

Molekylærbiologiens historie 1953 Watson & Crick: DNA dobbelheliks 1966 Nirenberg, Mattaei, Khorana & Holley: Genetiske kode 1972 Berg: Første rekombinante DNA-molekyl 1975 Southern: Blotting Sanger: DNA-sekvensering 1978 Botstein: RFLP 1982 Augenlicht & Kobrin: Mikromatriser 1985 Mullis: PCR 1990 HUGO lanseres 1996 Dolly klones 2001 Humane genom publiseres Bass: RNAi

PCR: Renser (kloner) en bit av DNA vekk fra resterende genom Renset DNA kan brukes til: Sekvensering Diagnostikk av genetiske sykdommer Deteksjon av virale infeksjoner Identifisering av liten mengde materiale – rettsmedisin SNP analyser (med mer) Kvantitering av DNA eller mRNA (’Real time’ PCR)

Hva må til for å kjøre PCR? Templat: DNA (ev. mRNA) Primere Deoksynukleotider (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Taq polymerase Reaksjonsbuffer ([Mg2+] er viktig!) PCR maskin (Thermocycler)

Primerdesign er viktig for PCR: Primere skal være komplementære til DNA Alltid 2 primere; en for hver side av DNA-stykket som skal amplifiseres (kalles ”forward” og ”revers” ev. sense og antisense) Primere skal være spesifikke, dvs. ingen homologi med annet DNA Typisk lengde: 18-24 baser Smeltetemperaturen, Tm, skal være likest mulig for de to primerne.

Deteksjon av PCR produkter skjer ved farging av det amplifiserte DNA med ethidiumbromid og elektroforese i en agarose gel

PCR er en eksponensiell amplifisering

Konvensjonell PCR sammenlignet med ’real time’ Konvensjonell PCR er en endepunktsdeteksjon: Dårlig presisjon Lav oppløselighet Lav sensitivitet Ikke automatisert (må kjøre gel for å få resultatet) Resultatet er ikke numerisk uttrykt Ethidiumbromid-farging er ikke særlig kvantitativt

Kvantitering ikke mulig med konvensjonell PCR. ’Real time’ PCR hvor økning i PCR-produkt kan følges på skjerm Ethidium bromid farging av gel etter konvensjonell PCR

’Real time’ PCR (Eks. Lightcycler) Deteksjon skjer ved et fluorescens-signal vist på skjerm under PCR-reaksjonen  slipper gel-elektroforese og ethidium bromid Fluorescens-signalet er proposjonalt med mengde DNA  kvantitativt mål for mengde DNA i utgangsmaterialet Hybridiseringsprober i tillegg til primere  konfirmasjon av PCR-produktets identitet Hybridiseringsprober er spesielt godt egnet til smeltepunktsanalyse og mutasjonsdeteksjon

SNP (single nucleotide polymorphism): SNP finnes i gjennomsnitt 1/1000 baser i det humane genom Viktige redskap for genetisk testing, identifisering av sykdomsgener og farmakagenomikk Ønskelig med raske metoder som kan undersøke store DNA-områder på kort tid

Mutasjonsdeteksjon: Deteksjonsproben må dekke mutasjonsstedet og være komplimentær til vill-typen

Mutasjonsdeteksjon: Hybridiseringsprobens Tm avhenger av homologi med templatet En probe med én mismatch i forhold til templatet vil smelte av ved lavere temperatur enn en probe med 100% homologi

Ved sakte heving av temperaturen vil proben med laveste smeltetemperatur, Tm, dvs. dårligste komplimentaritet med templatet, smelte av først. Dette detekteres som et fall i fluorescence fordi probene ikke lenger er nær hverandre.

Sekvensering : (Sanger, F. et al., J Mol Biol 1975; 94, 441) Forutsi aminosyresammensetningen i proteiner Kartlegge gener (HUGO) Identifisere exons (proteinkodende regioner) innen gener Identifisere regulatorområder (promotor, enhancer etc.) Identifisere konserverte sekvensmotiv mellom arter Identifisere SNP (med mer)

Sanger sekvensering : (Chain terminator method) To trinns prosess: DNA som skal sekvenseres er templat for enzymatisk syntese av nytt DNA. Syntesen begynner ved et definert primersete Inkorporering av dideoksy-nukleotider stopper reaksjonen (tilfeldig)

Hva må til for å sekvensere?

Deoksynukleotider er byggesteinene i DNA molekylet http://lifesciences.asu.edu/resources/mamajis/sequencing/sequencing.html Deoksynukleotider er byggesteinene i DNA molekylet Dideoksynukleotider mangler 3’-OH-gruppe Inkorporering av et dideoksynuklotid stanser polymerisering Reaksjonen kjøres med dNTP/ddNTP > 1 http://www.bio.davidson.edu/courses/Bio111/seq.html

Merking med fluorescein : Ikke radioaktivitet, en kolonne på gelen, og automatisering Til venstre : Radioaktiv sekvensering hvor fire sekvenseringsreaksjoner kjøres parallelt. DNA separeres ved elektroforese på en polyacrylamid /urea-gel. DNA-båndene visualiseres ved røntgen-film og sekvensen leses nedenfra Til høyre: Dye-terminator sekvensering. Hver av dideoksynukleotidene merkes med ulik fluoriscerende farge og kan kjøres i samme sekvenseringsreaksjon

Sekvensering brukt til mutasjonsdeteksjon © 2003 by Steven M. Carr

RFLP: Restriction fragment length polymorphism Gammel molekylærbiologisk metode: * Screening av sykdomsgener * DNA-fingeravtrykk i rettsmedisin Fordel: Meget nøyaktig http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RFLPs.html

Prinsipp for RFLP: Restriksjonsenzym EcoRI

RFLP metode: Digestion Restriction Apply to Gel DNA Fragments Electrophoresis Southern Blotting DNA Fragments on Membrane Hybridized Fragments Autoradiogram or Lumigram

Sigd-celle anemi: RFLP identifiserer SNP: Arvelig recessiv sykdom hvor glutaminsyre i posisjon 6 i beta-kjeden av hemoglobinet er byttet ut med valin SNP-en gjenkjennes av et restriksjonsenzym Syk, CCTGTGG Frisk, CCTGAGG http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RFLPs.html

Southern blot: Dobbelttrådet DNA-fragmenter separeres på gel Nitrocellulosepapir eller nylonmembran legges over gelen og papirhåndklær legges på toppen. Bufferen trekkes i gjennom mens den denaturerer DNA slik at enkelttråder fester seg på nitrocellulosen. Nitrocellulosen fjernes forsiktig fra gelen. Nitrocellulosepapiret legges i en buffer som inneholder radioaktivt merket probe. Papiret vaskes grundig slik at bare probe som er bundet til DNA er tilbake. Papiret legges sammen med en film som svertes der hvor proben har bundet seg. Northern blot fungerer på samme måte, men med sekvenser spesifikke for mRNA i stedet for DNA

DNA kloning 111yy 112yy 113yy 4 116yy 115yy http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/index.php#Anchor-Biological-3800

Ekspresjonskloning Protein

FISH: fluorescence in situ hybridization Lokalisering av gener på kromosomer Deteksjon av kromosom abnormaliteter: aneuploiditet translokasjoner mikrodelesjoner

Prinsipp for FISH:

Interfase (kjerne)-FISH: aneuploiditets test http://members.aol.com/chrominfo/intfish.htm Trisomi 21: Grønn = kromosom 13, Rød = kromosom 21

Metafase-FISH: Deteksjon av BRCA2 på kromosom 13 http://pathology2.jhu.edu/pancreas/geneticsweb/fish.htm

Mikromatriser Kvantitere og sammenligne genekspresjon i stor skala Brukt mye til klassifisering av maligne sykdommer Øyeblikksbilde/tidsstudier (for eks. cellesyklus) Tidkrevende og dyrt – planlegg nøye: MIAME = minimum information about a microarray experiment (http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html)

http:// pga.maw.edu/pga/jsp/components/education/CHS_2001_Kwitec

Rødt representerer kontroll cDNA Grønt representerer prøve cDNA Gult representerer en kombinasjon av prøve og kontroll hvor begge hybridiserer likt til proben Svart representerer områder hvor verken prøve eller kontroll har bundet seg http://www.ncbi.nlm.nih.gov/About/primer/microarrays.html

Hierarkisk clustering: Dendrogram som baserer seg på at co-ekspresjon indikerer co-regulering Korte grener indikerer høy korrelasjon Lange grener indikerer lav korrelasjon

Hvor mange gener er involvert i cellesyklus- regulering? Studier av HeLa cellelinjen viste at 850 gener har periodisk ekspresjon gjennom cellesyklus. From the following article: Common markers of proliferation Michael L. Whitfield, Lacy K. George, Gavin D. Grant and Charles M. Perou Nature Reviews Cancer 6, 99-106 (February 2006)

To-farge kontra en-farge mikromatriser

To-kanals En-kanal Måler relativ forskjell i genekpresjon Foretrukket for målinger mellom forskjellige typer vev, tidspunkter etc En-kanal Måler absolutt nivå av genekspresjon Har samme probe på flere forskjellige steder på chipen Har prober med ”perfect match” (PM) til genet og prober med en ”mismatch” (MM) i midten av proben – kan korrigere for uspesifikk binding Agilient, Eppendorf, Telechem Affymetrix, Applied Microarrays, Eppendorf

RNA interferens (RNAi): Translasjonskontroll mRNA ødelegges vha sekvensspesifikk degradering Resultat Redusert / ingen genekspresjon Brukes til Genfunksjonsstudier

1) Lange dsRNA -biter transfekteres inn i cellen 2) Dicer (RNAse III enzym) kutter dsRNA inn i mindre biter (siRNA) 3) siRNA biter (21-25 nt lange) binder seg til RNA- inducing silencing complex (RISC) 4) siRNA denatureres (vha ATP), RISC aktiveres og binder mål-mRNA. Subenheter av RISC kutter mRNA 5) Andre proteiner degraderer mRNA ytterligere og hindrer ekspresjon av målproteinet

Eksempel på ”knock out” av enzymet GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ved hjelp av RNAi i HeLa celler: I venstre panel: Tilfeldig siRNA introdusert (ikke komplementært til GAPDH mRNA) I høyre panel: siRNA komplementært til GAPDH slår ut mRNA og proteinet blir ikke uttrykt http://fig.cox.miami.edu/~cmallery/150/gene/siRNA.htm Rødt: Merket siRNA Blått: Kjernefarging Grønt: GAPDH protein