Cellekommunikasjon PBM 135 - Høsten 2002 Prof. Finn Olav Levy, dr.med. Tlf.: 22840237 E-post: f.o.levy@klinmed.uio.no

Cellekommunikasjon- hovedtyper Endokrin Hormoner Parakrin Lokalt virkende hormoner Vekstfaktorer Cytokiner Spesialtilfelle: Autokrin Synaptisk Kjemisk (nerveceller): Nevrotransmittere Elektrisk (hjerte, tarm): Via gap junctions Kontaktavhengig Alberts et al. 2002, Fig. 15-4

Endokrin signalering Hormoner Dannes i indresekretoriske kjertler Skilles ut i blodet Virker i små konsentrasjoner Bare celler som har reseptor påvirkes

Hormoner - typer Proteiner – peptider Aminosyrederivater Steroider Mange (fra 3 aa til lange proteiner) Aminosyrederivater Biogene aminer (Katekolaminer, dopamin, serotonin, histamin) Thyroxin Steroider Glukokortikoider (cortisol) Mineralokortikoider (aldosteron) Androgener (testosteron) Østrogener (østradiol) Progestiner (progesteron) Vitamin D Retinoider (vitamin A)

Parakrin signalering Ikke skarpt skille endokrin/parakrin Lokalt virkende hormoner Div. tarmpeptider Vekstfaktorer Epidermal vekstfaktor (EGF) Platederivert vekstfaktor (PDGF) Transforming growth factor (TGF) b m.fl. Cytokiner Interleukiner Hematopoietiske vekstfaktorer Tumor nekrosefaktor (TNF) a/b Interferon (IFN) a, b og g Eicosanider (prostaglandiner, leukotriener, tromboxaner) Gasser NO CO

Nevrotransmisjon Kjemisk signal over synapsespalten Transmitterkriterier: Syntese eller opptak Frisetting ved nervestimulering Eksogen tilførsel etterlikner Blokkeres ved antagonister Inaktiveringssystem Klassiske nevrotransmittere Acetylcholin (ACh) Aminer (A, NA, DA, 5-HT, H) Aminosyrer/-derivater (GABA, Nyere nevrotransmittere Peptider

Reseptorer Bestemmer hvilke signaler en celle kan reagere på Spesifisitet Høy affinitet for ligand Reversibel binding (ikke alltid) Begrenset antall Binding av ligand setter i gang effekt To hovedgrupper: Intracellulære For lipofile ligander og gasser Reseptorer i cellemembranen (Membranreseptorer) Trenger signaloverføringssystem

Cellekommunikasjon - reseptorgrupper Intracellulære reseptorer Kjernereseptor-superfamilien Reseptor for NO Reseptorer i cellemembranen Ligand-regulerte ionekanaler G-protein-koblede reseptorer Enzym-koblede reseptorer (oftest kinase- eller fosfataseaktivitet)

Intracellulære reseptorer Kjernereseptor-superfamilien Gen-regulering (er ligand-aktiverte transkripsjonsfaktorer) Langsomme effekter Totalt ca. 50 Ligander: Klassiske Steroidhormoner Thyroideahormoner Vitamin D Retinoider (vitamin A) Nyere Fibrater (PPAR) Fettstoffer Metabolitter Toxiner Flere uidentifiserte Alberts et al. 2002, Fig. 15-13

Intracellulære reseptorer Kjernereseptor-superfamilien Tre domener Ligand-bindende DNA-bindende Transkripsjons-aktiverende Bare gener med riktig element i promoteren reguleres Alberts et al. 2002, Fig. 15-13

Intracellulære reseptorer Reseptor for NO NO-reseptoren er et enzym (guanylyl-syklase) Lager cGMP fra GTP (guanylyl-syklase) cGMP: virker via cGMP-avh. protein kinase brytes ned av cGMP-PDE (fosfodiesterase; hemmes av Viagra) Alberts et al. 2002, Fig. 15-11

Cellulær signaloverføring - reseptorgrupper Intracellulære reseptorer Reseptorer i cellemembranen Ligand-regulerte ionekanaler G-protein-koblede reseptorer Enzym-koblede reseptorer (oftest kinase- eller fosfataseaktivitet)

Reseptorer i cellemembranen – tre grupper Alberts et al. 2002, Fig. 15-15

Cellulær signaloverføring - reseptorgrupper Intracellulære reseptorer Reseptorer i cellemembranen Ligand-regulerte ionekanaler (Kapittel 11 – Membrantransport) G-protein-koblede reseptorer Enzym-koblede reseptorer (oftest kinase- eller fosfataseaktivitet) Alberts et al. 2002, Fig. 11-36

Ligand-regulerte ionekanaler Ionekanaler som åpnes ved binding av ligand Eksit. og inhib. nevrotransmitter-reseptorer Eksitatoriske (Natrium/Kalsium-influks) Nikotinbindende acetycholinreseptor (NACh-R) Na+, K+, Ca2+ I praksis: Influks av Na+ --> depolarisering Glutamat-reseptorer AMPA-reseptorer (Kainat-type, Quisqualat A-type) Na+/K+ NMDA Na+/K+/Ca2+ Blokkeres av ekstracell. Mg2+ - krever også depol. Serotonin-reseptoren 5-HT3 Na+, K+ Alberts et al. 2002, Fig. 11-36

Ligand-regulerte ionekanaler Ionekanaler som åpnes ved binding av ligand Inhibitoriske (Klorid-influks) GABA-A -reseptor Reseptor for barbiturater og benzodiazepiner (Valium o.l.) Glycin-reseptor

Signaloverføring - skjematisk Alberts et al. 2002, Fig. 15-1

Signaloverføring Prinsipper Proteiner i signalkjeden kan være: Formidlere – sender signalet videre til neste ledd Budbringere – bringer signalet til et annet sted i cellen Adaptere – binder sammen to signalmolekyler Forsterkere – f.eks. ved å danne flere nye signalmolekyler Omformere – f.eks. danne nytt signalmolekyl Forgrenere – aktiverer flere nedstrøms signalveier Integratorer – tar i mot signal fra flere signalveier, videre signal kan f.eks. være avhengig av at begge er tilstede Forankring Signalkjeder holdes sammen eller lokaliseres til bestemte strukturer ved forskjellige typer forankringsproteiner (scaffold, anchoring, docking proteins) Alberts et al. 2002, Fig. 15-16

Protein-fosforylering Reversibel protein-fosforylering svært viktig biologisk reguleringsmekanisme Fosforylering: Protein-kinaser Defosforylering: Protein-fosfataser ATP ADP Protein-OH Protein-PO4 Protein-fosfatase Protein-kinase H2O Pi

Protein-kinaser i signaloverføring Ser/Thr-kinaser cAMP-avhengig protein-kinase (PKA) Reseptor for syklisk AMP (cAMP) To regulatoriske (R) og to katalytiske (C) subenheter cAMP-binding frigir aktive katalytiske subenheter cGMP-avhengig protein-kinase (PKG) Reseptor for cGMP R og C i samme protein, ellers som PKA Alberts et al. 2002, Fig. 15-32

Protein-kinaser i signaloverføring Ser/Thr-kinaser, Tyr-kinaser Protein-kinase C (PKC) Ca2+/fosfolipid-avhengig protein-kinase Aktiveres av Ca2+ og DAG (diacylglycerol) Mange subtyper Ca2+/Calmodulin-avhengige protein-kinaser Flere subtyper Tyrosin-kinaser Reseptor tyrosin-kinaser (mange forskjellige) Non-reseptor tyrosin-kinaser (mange forskjellige)

Protein-fosfataser Ser/Thr-fosfataser Tyr-fosfataser Protein fosfatase I Protein fosfatase IIA Protein fosfatase IIB Calcineurin Ca2+-aktivert Mål for immunsuppresive legemidler Protein fosfatase IIC Tyr-fosfataser Mange (se senere)

Signaloverføring Prinsipper Molekylære brytere Protein-fosforylering GTP-binding Alberts et al. 2002, Fig. 15-17

Signaloverføring Prinsipper Signal-integrering (koinsidens-deteksjon) Alberts et al. 2002, Fig. 15-18

Signaloverføring Prinsipper Signalkomplekser Preformerte eller Rekrutteres som følge av signal Alberts et al. 2002, Fig. 15-19

Signaloverføring Prinsipper Mange signalproteiner består av funksjonelle moduler, f.eks.: Bindingsdomener PDZ PH PTB SH2 SH3 Katalytiske domener Regulatoriske domener Alberts et al. 2002, Fig. 15-20

Signaloverføring Prinsipper Mekanismer for å justere følsomheten Adaptasjon, desensitivisering Viktig for mange legemidler (tilvenning, tachyfylakse) Alberts et al. 2002, Fig. 15-25

Cellekommunikasjon - Reseptorgrupper Intracellulære reseptorer Reseptorer i cellemembranen Ligand-regulerte ionekanaler G-protein-koblede reseptorer Reseptor G-protein Effektor Enzym-koblede reseptorer (oftest kinase- eller fosfataseaktivitet) Alberts et al. 2002, Fig. 15-26

G-protein-mediert signaloverføring Reseptor, G-protein, Effektor Flere hundre forskjellige - kan være mange forskjellige for hvert signalmolekyl G-protein a-, b- og g-subenheter Tre hovedfamilier, inndelt etter a-subenheten Effektor Adenylyl-syklase Fosfolipaser Ionekanaler cGMP fosfodiesterase (synsmekanismen i retina)

G-protein-mediert signaloverføring Clapham DE & Neer EJ, Annu Rev Pharmacol Toxicol 37:167-203, 1997

G-protein-mediert signaloverføring Regulering av adenylyl-syklase

G-protein-koblede reseptorer En av de største protein-familiene Mål for mer enn 50% av alle legemidler Omfatter reseptorer for de fleste signalstoffer: Aminer (katekolaminer, serotonin, dopamin) Acetylcholin (muskarinbindende ACh-res.) Aminosyrer/-derivater (mGlu, GABAB) Eicosanoider (prostaglandiner m.m.) Nukleosider/Nukleotider (adenosin, ATP) Peptider (PTH, vasopressin, oxytocin, TRH, ACTH, glukagon) Glykoprotein-hormoner (LH/CG, FSH, TSH) Proteaser (thrombin) Ioner (Ca2+) Lukt Synspigment (rhodopsin) m.m.

G-protein-koblede reseptorer Struktur 7 hydrofobe, transmembrane domener 7-transmembrane spanning receptors, 7-TMS receptors Serpentine receptors Heptahelical receptors Størst likhet i transmembrane områder Mest varierende: N-terminus (ekstracellulær) 3. intracellulære domene C-terminus (intracellulær) Two-dimensional model of the 2receptor illustrating the key structural features of a GPCR belongingto the "rhodopsin-like" subfamily. The most conserved residuein each transmembrane segments is indicated both using the Schwartznomenclature (59) and the Ballesteros-Weinstein nomenclature (15). Inthe Schwartz nomenclature the most conserved residue in each helix hadbeen given a generic number according to its position in the helix. Inthe Ballesteros-Weinstein nomenclature the most conserved residue ineach helix had been given the number 50. A series of conservedtryptophans and prolines are indicated in blue. The kinkthat may be caused by ProVI:15 has been suggested to be critical forthe conformational changes involved in receptor activation (49). Thealmost invariable disulfide bridge between extracellular loops 2 and 3 and the conserved palmitoylation site in the C-terminal tail areindicated in white. Residues AspIII:08, SerV:12, SerV:16,PheVI:17, and AsnVI:20 shown to be involved in binding of epinephrineto the 2 adrenergic receptor are indicated inred (3, 60). Mutations at Ala293(green) in the 1b receptor lead toagonist-independent activation (31). Other residues are discussed inthe text. Gether U & Kobilka BK, JBC 273:17979-82, 1998

G-protein-koblede reseptorer Variasjoner over et tema Ji TH et al., JBC 273:17299-17302, 1998

G-protein-mediert signaloverføring G-proteiner Historie Først påvist i forbindelse med aktivering av adenylyl-syklase ved glukagon (1970, 1980) Senere påvist i forbindelse med overføring av lyssignaler til nerveimpulser i netthinnen (1975, 1980) (Lys-aktivert rhodopsin  GTP-Transducin  Aktiverer cGMP-PDE  cGMP fjernes  cGMP-regulerte Na+-kanaler lukkes  Hyperpolarisering  Red. frigjøring av inhibitorisk transmitter  Eksitasjon av postsynaptiske nerveceller) Både positiv og negativ regulering av adenylyl-syklase (AC) via G-protein Gs (stimulerer AC): Aktiveres irreversibelt av cholera-toxin (kolera) Gi (hemmer AC): Inaktiveres irreversibelt av pertussis-toxin (kikhoste)

G-protein-mediert signaloverføring G-proteiner Tre subenheter (a, b, g) a-subenheten Binder og hydrolyserer GTP (aktivering - inaktivering) Dissosierer fra bg ved stimulering (aktivering) Påvirker effektorsystemet (eks. adenylyl-syklase) til økt/redusert aktivitet Minst 16 forskjellige a-subenheter i tre hovedfamilier: I: Gs, Golf: Stim. AC II: Gi, Go, Gt: Bl.a. hemmer AC III: Gq: Stim PL-C bg-subenheten Forankrer G-proteinet i membr. Egne signalfunksjoner Minst 6 forskj. b-subenheter Minst 12 forskj. g-subenheter Alberts et al. 2002, Fig. 15-27 Alberts et al. 2002, Fig. 15-27

G-protein Aktivering/Inaktivering Aktivert reseptor katalyserer GDP-frigjøring (hastighetsbegrensende trinn, binding av GTP skjer deretter) Dvs. aktivert reseptor er “GDP-releasing factor” GTPase-aktivitet skrur G-proteinet av Regulatorisk syklus: Alberts et al. 2002, Fig. 15-28

G-protein-mediert signaloverføring Effektorsystemer Adenylyl-syklase  cAMP  PKA Fosfolipaser Fosfolipase C  IP3 ( Ca2+) og DAG ( PKC) Fosfolipase A2  Arakidonsyre  Prostaglandiner m.m. Fosfolipase D Ionekanaler K+-kanaler Ca2+-kanaler cGMP fosfodiesterase (synsmekanismen i retina) Alberts et al. 2002, Fig. 15-29

Serotonin-reseptorer Eksempel på mange reseptorer og signalveier for et signalmolekyl

G-proteiner: Effektorsystemer Adenylyl-syklaser Danner syklisk AMP (cAMP) fra ATP (MgATP) Minst 8 forskjellige subtyper 2 x 6 transmembrane områder Forskjellige subtyper reguleres av: Gas (+) Gai (-) Gao (+/-) Gbg (+/-) Ca2+ (+/-) Forskolin (+) Nedbrytning av cAMP: fosfodiesteraser (PDE) – mange forskjellige – kan også forankres og reguleres Virkning av cAMP: Via cAMP-avhengig protein-kinase, mange forskjellige effekter Alberts et al. 2002, Fig. 15-33

cAMP som second messenger Adenylyl-syklase danner syklisk AMP (cAMP) fra ATP Nedbrytning av cAMP: Fosfodiesteraser (PDE) – mange forskjellige – kan også forankres og reguleres Virkninger av cAMP: Aktiverer cAMP-avhengig protein-kinase (PKA)  fosforylering av mange forskjellige proteiner Ionekanaler Nyeste: Epac (cAMP-aktivert Rap-GAP) Alberts et al. 2002, Fig. 15-33

G-proteiner: Effektorsystemer Fosfolipase C (PL-C) Spalter PIP2 til IP3 og DAG IP3 gir Ca2+-frigjøring DAG aktiverer PKC Subtyper PL-Cb (b1, b2, b3) - reguleres av G-protein PL-Cg (g1, g2) - reguleres av tyrosin-kinaser PL-Cd (d1, d2, d3) - regulering dårlig kjent Alberts et al. 2002, Fig. 15-35

G-proteiner: Effektorsystemer Andre fosfolipaser Fosfolipase A2 (PL-A2) Spalter av arakidonsyre fra fosfolipider Arakidonsyre  Prostaglandiner, Leukotriener m.m. Sannsynlig regulering ved G-proteiner Fosfolipase D Spalter av fosfocholin fra fosfolipider Sannsynlig regulering ved G-proteiner, PKC, Ca2+ og tyrosin-kinaser

Aktivering av protein-kinase C (PKC) via fosfolipase C (PL-C) Alberts et al. 2002, Fig. 15-36

Ca2+ som second messenger Intracellulær Ca2+-kons.: 10-7 M Holdes nede vha. forskj. pumpe-mekanismer Stimulering av cellen kan øke [Ca2+]i til 10-3 M Mekanismer: IP3-reseptorer i ER er ligand-styrte Ca2+-kanaler Ca2+-kanaler i cellemembranen åpnes og slipper Ca2+ inn i cellen Andre Ca2+-kanaler i SR/ER Økning av [Ca2+]i kan visualiseres vha. Ca2+-følsomme fluorescerende stoffer: Alberts et al. 2002, Fig. 15-37

Vedlikehold av lav intracellulær Ca2+-konsentrasjon Alberts et al. 2002, Fig. 15-38

Ca2+ virker via Ca2+-bindende proteiner Viktigst: Calmodulin (CaM) Opptil 1% av cellens proteinmasse Medierer nesten alle Ca2+-effekter, bl.a. via Ca2+/CaM-avhengige protein-kinaser (CaM-kinaser) I skjelettmuskel: Troponin C Alberts et al. 2002, Fig. 15-40

CaM-kinase II som frekvens-dekoder 1. Ca2+-oscillasjoner 2. Aktivering av CaM-kinase II 3. Effekt av økt frekvens Alberts et al. 2002, Figs. 15-39, 15-41 & 15-42

G-protein-koblede reseptorer Regulering av følsomhet - desensitivisering Mekanismer: Fosforylering av reseptor Binding av arrestin Hindrer kobling til G-protein Setter i gang internalisering av reseptor (binder til clathrin) Alberts et al. 2002, Fig. 15-48