Nukleosomet

Forskjellige modeller for 30 nm-fibre

Ikke-Waston-Crick-basepar Parring mellom adeninrester i krystallstrukturen av 9-metyladenin Hoogsteen-parring mellom adenin- og tyminrester i krystallstrukturen av 9-metyladenin/1-metyltymin Hypotetisk parring mellom cytosin- og tyminrester

Noen mulige basepar

..og enda flere

IR-spektrometri i upolare løsemidler viser hydrogenbindinger

Modifiserte nukleosider i tRNA

Skjematisk oversikt over sekundærstrukturen til tRNA: kløverbladstrukturen.

The structure of the RNA of B. subtilis RNase P.. (a) Predicted secondary structure with specificity domain drawn in various colors and catalytic domain is black

The structure of the RNA of B. subtilis RNase P. (b) The X-ray structure of the specificity domain in which its various segments are colored as in Part a.

Strukturen av gjær-tRNAPhe

Tertiær baseparring i tRNA

16S-rRNA-sekundærstruktur (E. coli og archae, pattedyr, mitokondrier)

Strukturen av et hammerhode-ribozym Venstre: Sekundærstruktur hvor prikkede linjer representerer Watson-Crick-basepar og ikke-WC-basepar representeres med heltrukne blå linjer Midt: RNA rød-blå, DNA gul-grønn Høyre: Skjematisk diagram av ribozymet

Forskjellige systemer for skjematisk fremstilling av RNA-strukturer

1958: the central dogma DNA dirigerer replikasjon (DNA til DNA) og transkripsjon (DNA til RNA) og RNA dirigerer protein syntese (translasjon)

Disposisjon Hvordan foregår transkripsjon? Proteiner og andre komponenter Prosesser og mekanismer Medikamenter Logikk - hva forventes - hva finner vi? Hvordan reguleres transkripsjon Logikk - hvilke angrepsmåter er sannsynlige? Noen eksempler på ulike strategier

4 etapper Binding Initiering Elongering Terminering

Enzymet = RNA polymerase Oppdaget 1960 Samuel Weiss og Jerard Hurwitz RNAn + NTP + (Mg++ + templat) = RNAn+1 + PPi I bakterier - et enzym Med unntak av primase Noen fag koder for egne RNA polymeraser Polypeptid sammensetning 449 kDa a2bb´s

Flere eukaryote RNA pol ansvarlig for ulike RNA RNA polymerase I rRNA - en promoter RNA polymerase II mRNA - komplekse promotere RNA polymerase III 5S RNA og tRNA - intrageniske promotere

Components of E. coli RNA Polymerase Holoenzyme. Page 1221

RNA Polymerase Subunitsa. Page 1232

3D struktur E.coli RNA pol T7 RNA polymerase

3D av Eukaryot RNA pol Gjær RNA polymerase (lav resolusjon)

Flere kanaler i yRNAPII

Mot høyere resolusjon

yRNAPII yRNAPII

An electron micrograph of E An electron micrograph of E. coli RNA polymerase (RNAP) holoenzyme attached to various promoter sites on bacteriophage T7 DNA. Page 1222

X-Ray structure of Taq RNAP core enzyme.. Page 1224 a subunits are yellow and green, b subunit is cyan, b¢ subunit is pink, w subunit is gray

X-Ray structure of Taq RNAP. (b) The holoenzyme viewed as in Part a. Page 1224

Model of the closed (RPc) complex of Taq RNAP with promoter-containing DNA extending between positions –60 and +25. Page 1225

Model of the open (Rpo) complex of Taq RNAP with promoter-containing DNA showing the transcription bubble and the active site. Page 1225

Templatbinding

Bindingens logikk - hva kan vi forvente? Sekvensspesifikk binding Sterkere binding til promoter enn til DNA generelt Sterk binding gir effektiv RNA syntese, mens svak binding gir lavere nivåer av mRNA Kjedeseparasjon før RNA-syntese

Promoterbinding RNA pol danner sterke kompleks med promotere Kd = 10-14M DNase-proteksjon -20 til +20 To konserverte områder oppstrøms -10 region (Pribnow-box) TATAAT -35 region (optimalt TTGACA) Initieringsregion: +1 alltid A (CAT) eller G (CGT) Sigma er bestemmende for spesifisitet

Initiering - hva er sekvens-signalet? To konserverte regioner

Dannelse av åpent kompleks - separasjon av tråder Området fra -9 til +2 åpnes Evidens DMS-footprinting 3´-OH NTP RNA

Initiering

Initieringens logikk - hva kan vi forvente? Enzymatisk reaksjon NTP + Mg++ + templat = RNA + PPi Energi fra hvor? Retning på kobling?

Uventet: abortiv initiering Initiert RNA syntese ofte abortert etter 2-9 nukleotider Oppfylling av RNA kanal - før overgang til elongeringskonformasjon

Medikament: Rifampicin inhiberer prokaryot transkripsjon Streptomyces m. produkt = rifamycin B Semisyntetisk rifampicin Inhiberer spesifikt prokaryot transkripsjon via binding til b-subenhet og lager et bundet men blokkert enzym

Elongering

Elongeringens logikk - hva kan vi forvente? Kompleks av prosessiv type som forblir værende i samme kompleks og forlenger det RNA som ble initiert Topologisk nøtt

Retning av polymerisering Her vil innmerking holde seg lenge selv om hot GTP erstattes med kald Her vil innmerking raskt forsvinne når hot GTP erstattes med kald

Medikament: cordycepin (3-deoksyadenosin) Blokkerer bakteriell RNA syntese Virker ved inkorporering og kjedeterminering

Topologisk konsekvens av polymerisering Hva er mest hensiktsmessig å snurre? RNA polymerasen - NEI DNA templaten - JA

Transkripsjon leder til supercoiling Når uparet transkripsjonsboble beveger seg, dannes Foran: positiv supercoiling (tettere tvunnet) Plasmid blir positivt supercoilet i gyrasemutant Bak: negativ supercoiling (undertvunnet) Plasmid blir negativt supercoilet i topo I-mutant

Hvor rask skjer elongering? Hvor mye feil? In vivo: 20-50 nt per sek Initiering opp til 1x per sek Fidelitet: feilinkorporering 1: 104

Medikament: det interkalerende middel Actinomycin D Binder sterkt via interkalering og blokkerer både transkripsjon og replikasjon Interkalering via phenoxazone ring Minor groove binding av peptid del

Terminering

Termineringens logikk - hva kan vi forvente? Respons på et sekvenssignal Hva er signalet? Overgang fra sterkt elongeringskompleks til ustabilt termineringskompleks - hvordan skjer dette?

Signalet = GC-rik palindrom + U-strekk To-delt signal 4-10 A-T med Aene i templat Palindrom GC-rik region like foran Denne danner ”hairpin”

Modell Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer Forutsagt effekt av GTP til ITP (svekket terminering) Flere andre forhold bidrar Kontekst, NTP, supercoil osv

Assistert terminering - rho-avhengig Noen termineringsseter krever en hjelpefaktor (rho-faktor) Rho = Hexamer NTPase som katalyserer opptvinning (unwinding) Modell Rho binder RNA oppstrøms via et spesifikt motiv, migrerer mot polymerasen, opptvinning, frigjøring av transkript

Rho factor. Page 1231 The Rho protomer with its N-terminal domain cyan, its C-terminal domain red, and their connecting linker yellow.

Rho factor. Page 1231 The Rho hexamer. Its six subunits, each of which are drawn in a different color, form an open lock washer-shaped hexagonal ring.

Rho factor Page 1231 The solvent-accessible surface of the Rho hexamer as viewed from the top of Part b.

Hvordan regulere transkripsjon? Behov for regulering: Nivå: Noen mRNA trenges i store mengder, andre i små Timing: Forskjellige mRNA trenges til ulike tidspunkt Respons: Noen mRNA trenges bare i visse miljø (nærvær av ulike næringsstoffer) Hvordan oppnås ulike transkripsjonsnivå?

Rask endring i prokaryoter Koblet translasjon /transkripsjon gir respons innen minutter Translasjon av mRNA før transkripsjon er ferdig mRNAs levetid også kort (1-3min)

Enkel regulering av NIVÅ via ulike optimale promotere lacI genet er lavt uttrykt pga svak promoter (avvik fra consensus) <10 mlk pr celle Svak Svak 10000 mlk pr celle Sterk Sterk

Regulering av TIMING - serie av sigma-faktorer Utvikling/differensiering = tidsmessig ordnet ekspresjon av gen-programmer Fag-infeksjon - enkel modell for slik timing Early - middle - late genes B.subtilis infisert av fagen SP01 Early genes - via vertens RNAP/s - normale promotere Et tidlig produkt = sgp28 en ny s med endret promoterpreferanse Middle genes - via vertens RNAP/sgp28 - egne promotere Late genes - via vertens RNAP/sgp33/34 - egne promotere

Regulering av RESPONS - via repressorer (og aktivatorer) Prokaryot transkripsjons-regulering via tre elementer: Promotere gjenkjennes av RNA polymerasen Operatorer gjenkjennes av repressorer Positive kontrollelementer gjenkjennes av aktivatorer

Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter Aktiviteten av en promoter in vivo i fravær av regulatoriske sekvenser og aktivatorer/repressorer Prokaryoter: grunntilstand = åpen Ingen begrensning på RNA polymerasens tilgang til promotere Repressorer blokkerer tilgang Aktivatorer kun nødvendige på visse svake promotere Eukaryoter: grunntilstand = lukket (pga kromatin) En sterk core-promoter alene er inaktiv i eukaryoter De fleste eukaryote gener krever aktivatorer

Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter Prokaryoter Eukaryoter

Eksempel på repressorregulering av promotertilgang Lac operon Eksempel på repressorregulering av promotertilgang

Induksjon- tilpasning til næring E.coli lager enzymer for laktosefermentering kun når laktose er til stede + lactose - rask induksjon av galaktosid permease ß-galaktosidase Inducer = 1,6-allolactose Lab:IPTG

Genetisk kartlegging Operon Strukturelle gener Operator Promoter Proteinkodende Operator Bindingssekvens for regulator Promoter Bindingssekvens for RNA polymerase

Evidens for repressor Konstitutive mutasjoner – lac-operonet aktivt i fravær av inducer Mutasjon mappet til lacI genet lacI ligger utenfor operonet lacI virker i trans via kodet protein-produkt (lac repressor) Oc mutasjoner samme effekt men virker i cis (operator mutasjon)

Konjugasjon - evidens for at lacI virker i trans I+Z+ I-Z- Uten inducer ß-gal syntese starter pga Z+ Represjon forsinket Pga lacI virker i trans

The nucleotide sequence of the E. coli lac promoter–operator region. Page 1239

Systemet Uten inducer: AV Med inducer: PÅ Lac-repressor binder operator Med inducer: PÅ Lac-repressor inaktiveres av inducer

Lac repressor Tetramer Hver monomer binder IPTG Kd = 10-13M Tetramer Hver monomer binder IPTG DNA gjenkjenning via sliding Raskere enn diffusjon IPTG Kd = 10-6M

Mekanisme for Lac represjon Lac operator og promoter overlapper - trolig at repressor blokkerer tilgang for RNA pol Likevel, noe mer

X-Ray structure of the lac repressor subunit. Page 1248

X-ray structure of the lac repressor-DNA complex. Page 1249

NMR structure of the lac repressor-DNA complex. Page 1249

Model of the 93-bp DNA loop formed when lac repressor binds to O1 and O3. Page 1250

Eksempel på aktivering av gener via CAP-cAMP komplekset Katabolittrepresjon Eksempel på aktivering av gener via CAP-cAMP komplekset

Glukoses forrang Glukose foretrukket metabolitt Katabolitt represjon nærvær av glukose hindrer uttrykk av gener nødvendige for annen fermentering (laktose, arabinose, galaktose) Hvordan senses høy/lav glukose? via cAMP! Glukose senker cAMP-nivået

Eksempel på katabolittrepresjon – lac-operonet Lac-operonet ”skrus på” av laktose Lac-operonet ”skrus av” av glukose Katabolitt represjon Induksjon

CAP eller CRP Respons overfor cAMP skjer via CAP cAMP-bindende dimer = Catabolite gene activator protein Kalles også CRP (cAMP receptor protein) cAMP-bindende dimer Endrer konformasjon ved binding av cAMP 90o

Mekanisme for aktivering? CAP kan kontakte RNA pol direkte CAP binder oppstrøms initieringskompleks De to bindes i løsning CAP endrer DNA-konformasjonen 90o indusert bøyning - endrede relative posisjoner Major groove lukkes, minor åpnes CAPs effekt gjenskapes av DNA-sekvenser som spontant bøyes

To mulige mekanismer Posisjon Bøyning CAP x RNApol.

X-Ray structures of CAP–cAMP complexes X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (a) CAP–cAMP in complex with a palindromic 30-bp duplex DNA. Page 1241

X-Ray structures of CAP–cAMP complexes X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (b) CAP–cAMP in complex with a 44-bp palindromic DNA and the aCTD oriented similarly to Part a. Page 1241

X-Ray structures of CAP-cAMP complexes X-Ray structures of CAP-cAMP complexes. (c) CAP dimer’s two helix-turn-helix motifs bind in successive major grooves of the DNA. Page 1241

Sekvens-spesifikk DNA-binding Prinsipper og eksempler

Hvordan gjenkjennes sekvens fra utsiden? Elektrostatisk interaksjon Form/ geometri Hydrogen- bindinger Hydrofob interaksjon

Komplementære former Dimensjonen tilheliks passer dimensjonene i major groove av B-DNA Sidegruppene peker utover og er gunstig plassert for dannelse av hydrogenbindinger

Gjenkjenning via hydrogenbinding Hydrogenbinding er sentral for spesifikk gjenkjenning Hydrogenbindingspotensialet er ikke uttømt i dupleks DNA, ledige seter peker ut mot major groove D A A

Heliks-turn-heliks (HTH) motiv er vanlig i prokaryoter HTH = 2 a-helikser (120o kryss) 2.heliks = gjenkjenningsheliks 434 fag repressor

Et lignende eksempel - Cro protein fra 434 fag

Indirect read-out?

Unntak: DNA-binding via b-ribbon Met repressor Arc repressor

Arabinose-operonet

Stort oppstrøms kontrollområde

Kontroll via looping

X-Ray structure of E. coli AraC in complex with L-arabinose. Page 1247

Eksempel på regulering via både initiering og terminering Trp operon Eksempel på regulering via både initiering og terminering

nivå: repressor + corepressor Trp repressor binder tryptofan og styrkes som repressor Logikk: når Trp tilgjengelig, reduseres syntese TrpR + Trp binder operator og inhiberer operonet 70-fold Trp = korepressor (økt represjon) ≠ inducer som svekker represjon

Trp repressor - indusert DNA-binding Trp repressor binder sin operator kun i nærvær av tryptofan (rød)

Trp repressor

2. Nivå: regulering av terminering Trp operon har en lang ledersekvens (trpL)ds Lav Trp: hele den polycistroniske mRNA produseres Høy Trp: en kort versjon lages, prematurt terminert i trpL Attenuator = kontrollelement ansvarlig for prematur terminering

Trp-operon

Mekanisme for attenuering trpL: 4 segmenter og 2 konformasjoner med ulik effekt 1-2 i en mini-ORF med 2 Trp 3-4 er en klassisk terminator

Modell Mye Trp: ribosomet starter straks translasjon og fremmer konformasjonen som gir terminering Lite Trp: ribosomets venting på Trp-tRNA fremmer 2-3 konformasjon som tillater videre transkripsjon

Samspill mellom ribosomet og Trp-tRNA

Amino Acid Sequences of Some Leader Peptides in Operons Subject to Attentuation. Page 1253

Eksempel på regulering via signalmolekyl som speiler vekstforhold Stringent respons Eksempel på regulering via signalmolekyl som speiler vekstforhold

ppGpp Stringent respons: ved aminosyremangel skjer en metabolsk tilpasning hvor rRNA- og tRNA-syntesen reduseres 10-20 fold Ved stringent respons akkumuleres ppGpp Syntese: relA ATP + GTP = AMP + ppGpp Degradering: spoT

The posttranscriptional processing of E. coli rRNA.

The proposed stem-and-giant-loop secondary structure in the 23S region of the E. coli primary rRNA transcript..