Cellesignalisering II: Cytosoliske kinaser, integrering av signal, og signalveier fra plasmamembranen til kjernen Introduksjon Definisjon og klassifisering Kinasefamilier: Receptor/cytosol MAP kinase signalveier Cellulære responser regulert av MAPKer Protein kinase C Gjær to-hybridsystem Plante MAP kinaser Bakterielle kinaser Integrering og regulering av signalveier Lipid sekundære budbringere Fra plasmamembranen til kjernen Konklusjoner

Introduksjon Vekstfaktorer stimulerer celler til deling og differensiering Dette omfatter bl.a. dublisering av DNA i kjernen og mitose Ekstracellulære signalmolekyl fester på celleoverflata, hvordan formidles beskjeden til kjernen?

20.5 Signals pass from activated Ras to a cascade of protein kinases Figure 20-28

enzymatisk phosphorylering av proteiner eller fosfolipider Definisjon kinaser: enzymatisk phosphorylering av proteiner eller fosfolipider protein kinase phosphatase P Not phosphorylated Phosphorylated Inactive Active

Klassifisering Kinaser grupperes etter hvilke aminosyrer de fosforylerer, to klasser: tyrosin-kinaser gjenkjennelsessekvens: lys/arg-X-X-asp/glu-X-X-X-Tyr serine/threonin-kinaser gjenkjennelsessekvens: arg-arg-X-Ser-X- eller arg-arg-X-Thr-X

Fosforylering av Ser og Tyr donasjon av fosfat fra ATP

Kinase familier Ser/Thr kinaser omfatter: Tyr kinaser omfatter: cAPK (eller protein kinase A, PKA), cGMP-avhengig protein kinase, protein kinase B (PKB), protein kinase C (PKC), G protein koblet receptor kinase (bARK, rhodopsin kinase) Tyr kinaser omfatter: Receptor tyr kinaser = intern kinaseaktivitet i receptor cytosolisk domene (eks vekstfaktor R), cytosoliske: JAK1, JAK2, Tyk. JAKs involvert i cytokin rec sign, aktiverer STAT (transkripsjonsfaktor) Duale kinaser, involverer både Thr og Tyr: Mitogen aktiverte kinaser, MAPKs for fullstendige lister se: http://www.sdsc.edu/Kinases/pk_home.html

20.5 Phosphorylation of a tyrosine and a threonine activates MAP kinase Figure 20-30

Protein fosfataser Ser/thr fosfataser: -PP1, PP2A, PP2B... -PP1 reguleres indirekte ved cAPK fosforylering, mens PP2A er Ca2+-avhengig, og PP2B avhengig av Mg2+ -PP1 og PP2A hemmes av okadinsyre Tyr fosfataser: -to klasser: receptor bundne og intracellulære -PTP 1B, PTP 1C... -PTP 1B reguleres ved lokalisering, f.ex. ER/cytosol Dual spesifikke fosfataser, DSPs: -inkluderer bl.a MAPK fosfataser (MKP) -MKPs kodes for av minst 10 forskjellige gener

MAP kinase familien Alle Ras-koblede RTKs i mammalske celler aktiverer en høyt konservert kinase cascade som til slutt ender i aktivering av MAP kinase (mitogen aktivert protein eller ERK) MAPK aktiveres ved fosforylering av thr/tyr-kinase MAPKK (MEK) Mammaler uttrykker 4 grupper MAPKs hvor hver gruppe aktiveres av distinkte MEKs: -ERK1/2 (p42, p44) -p38 (p38a/b/d/g) -jun aminoterminal kinases (JNK 1/2/3) -ERK5

MAP kinase signalveier Studier i gjær, rundorm, bananflue og mammaler har avdekket en høyt konservert kaskade av protein kinaser som fungerer nedstrøms Ras: Aktivert Ras binder til N-terminal domene av Raf, en ser/thr kinase Raf binder og fosforylerer MEK, en kinase som fosforylerer tyr og ser MEK fosforylerer og aktiverer MAP kinase, en ser/thr kinase MAP kinase fosforylerer mange forskjellige protein inkludert transkripsjonsfaktorer, som medierer cellulære responser

MAP kinase kaskade aktivert nedstrøms Ras

Cellulære responser regulert av MAPK cellulære responser regulert av MAPKs: -kontroll av genuttrykk -celleproliferasjon -programmert celledød, apoptose eksperimentell tilnærming i mammaler: -geninaktivering -selektive hemmere mekanisme: -transkripsjon ved aktivering av transkripsjonsfaktorer allerede bundet til DNA eller ved dimerisering av transkripsjonsfaktorer -mRNA stabilisering i cytosol -translasjon ved fosforylering av translasjons initierings faktor 4

20.5 Multiple MAP kinase pathways are found in eukaryotic cells Figure 20-32

20.5 The yeast two-hybrid system can be used to demonstrate interaction of components in the pathway Figure 20-29

Protein kinase C, PKC Protein kinase C regulerer vekst, differensiering og membran prosesser PKC familien inkluderer 11 subtyper Alle isoformer PKC består av regulatorisk domene og katalystisk domene PKC kan aktiveres fra bl.a. PI-3K, PLCb, PLCg De 11 PKC subtypene kan deles inn i 3 klasser: -cPKC - Ca2+, DAG -nPKC - DAG, FFA -aPKC - PS, FFA

Plante MAP kinaser MAP kinase signalisering viktig i planters vekst og utvikling MAP kinase homologer er identifisert i planter, så som MAPKs, MAP2Ks, MAP3Ks og MAP4Ks biologiske responser regulert av MAPK signalveier i planter inkluderer: -respons til etylen, abscisinsyre, patogener og skade

Bakterielle kinaser Histidine og asparagin fosforyleres i bakterier To-komponent signaliseringssystem -deteksjon av stimulus fører til fosforylering av detektor protein i His-enhet -fosforylgruppe overføres så til respons regulator protein som fosforyleres på asp -dette endrer funksjon av sistnevnte protein, f.ex. økt DNA-binding og endring av transkripsjonsrate

To-komponent signaliseringsvei som tillater kjemotakse-reseptorer å kontrollere flagellbevegelse ved kjemotakse

20.7 Interaction and regulation of signaling pathways The effects of activation of GPCRs and RTKs is more complicated than a simple step-by-step cascade Stimulation of either GPCRs or RTKs often leads to production of multiple second messengers, and both types of receptors promote or inhibit production of many of the same second messengers The same cellular response may be induced by multiple signaling pathways Interaction of different signaling pathways permits fine-tuning of cellular activities

20.7 Multiple G proteins transduce signals to different effector proteins

20.7 Regulation of certain effectors by G and various G ·GTP complexes contributes to integration of cellular metabolism Figure 20-43

Lipid sekundære budbringere Membran fosfolipider viktig lager for lipid sekundære budbringere i ustimulerte celler Membran fosfolipider omfatter fosfolipider (PI, PE, PC) og sfingomyelin Produksjon av lipid sekundære budbringere reguleres av fosfolipase A2, C og D; og sfingomyelinase Prinsipielt to typer sek. budbringere: -lipid-derivater -forskjellige fosforyleringsformer av PI utført av lipid kinaser (f.ex. PI-3K, PI-4K)

Intra/inter-cellulære lipid sek. budbringere Intercellulære lipid budbringere: -plateaktiverende faktor (PAF) -lysofosfatidic acid (LPA) -eicosanoider (parakrin mekanisme) Intracellulære lipid budbringere -fosfatidylinositol fosfat (PIPs) -diacylglycerol (DAG) -ceramid -eicosanoider (autokrin mekanisme) Enzymer involvert: -PLA2, PI-PLC, PLD, SMase, PI-kinaser

Arachidonatkaskaden

Fosfolipase A2 frigjør umettede fettsyrer fra sn-2-posisjon i membran fosfolipider, regulerer produksjon av lyso-fosfolipid og umettede fettsyrer umettede fettsyrer omsettes momentant til eicosanoider via bl.a. cyclooksygenaser og lipoksygenaser 11 forskjellige typer PLA2 enzymer, kan deles inn i tre grupper: -sekretoriske PLA2 -cytosoliske, calsiumavhengige PLA2 -cytosoliske, calsiumuavhengige PLA2 3 PLA2-enzymer involvert i cellulær signalisering: gruppe IIA, IV og V

Funksjon: -de/re-acylering av membr. fosfolipider -eicosanoid, lPC-produksjon: prostaglandiner, leukotriener, lysofosfatid-syre (LPA) Regulering av signaliserings PLA2 enzymer: -sekretoriske: sekresjon, substrattilgang -cytosoliske: økning i intracellulær Ca2+, fosforylering (ser 505, 727), PIP2 (Huwiler et al, 2000) Cellulære responser: -inflammasjon -proliferasjon -genregulering (NF-kB)

Fosfolipase C og D fosfatidyl-spesifikk fosfolipase C, PI-PLC spalter PI i diacylglycerol (DAG) og inositol 3-fosfat (IP3) PI-PLC, hovedsaklig 3 former, men flere versjoner av hver form: -PLC-b (4) -PLC-d (4) -PLC-g (2) regulert via heterotrimere G-protein (b) eller reseptor tyr kinaser (g) fosfolipase D, PLD, substrat er fosfatidylcholin PC to mammalske PLD klonet, PLD1 og PLD2 regulering: PLC eller PKC, heterotrimere/monomere G-prot (rho)

Forskjellige fosforyleringsformer av fosfatidylinositol (PI)

Cellulære responser regulert av lipid sek. budbringere Arachidonyl-deriverte eicosanoider, LTB4, PGE2, HETEs etc. samt LPA og PAF virker via distinkte trimere G-protein-koblede reseptorer aktivering av disse reseptorer initierer intracellulære kinase-kaskader som omfatter PKC, MAPK, ... etc. PI sentralt reguleringspunkt i intracellulære signalresponser ved at forskjellige fosforyleringsformer utført av PI-kinaser regulerer kons av membranens innhold av PIP, PIP2, PIP3 PIP2 viktig som substrat for PI-PLC, PI-3K og som regulator av cPLA2 membranassosiasjon biologiske responser regulert av lipid sek. budbringere og PIPs, se fig.

Fem paralelle signalveier aktivert av G-protein reseptorer, reseptor tyrosin kinaser, eller begge

20.8 From plasma membrane to nucleus Many cellular responses induced by water-soluble hormones, growth factors, and neurotransmitters result from their effects on gene expression Such pathways usually involve activation of protein kinases that directly or indirectly phosphorylate specific transcription factors

20.8 CREB links cAMP signals to transcription Figure 20-48a

20.8 MAP kinase regulates the activity of many transcription factors Figure 20-48b

20.8 Phosphorylation-dependent protein degradation regulates NF-B Figure 20-49

Patient suffering from psoriasis

Secretory group IIa PLA2 is overexpressed in differentiated keratinocytes in psoriatic skin Andersen et al., Inflammation, 18,1,1994.

PLA2: ??? TNF-R1 IL-1-R1 snpPLA2 AA LTB4 cPLA2 P TRAF2 RIP TRAF6 IRAK Plasma membrane TRAF2 RIP TRAF6 IRAK MAP3K/NIK IKK NFB:IB IB P NFB Nucleus NF-kB binding to DNA

Anthonsen et al., J.Biol.Chem.276,38,35344,2001. snpPLA2 BLTR receptor AA PI 3-kinase LTB4 cPLA2 P l/iPKC p38 MAPK Membr.rearr. TNF-R1 IL-1-R1 MAP3K/NIK IKK NFB:IB NFB TRAF2 RIP IB P Nucleus NF-kB binding to DNA TRAF6 IRAK Plasma membrane Anthonsen et al., J.Biol.Chem.276,38,35344,2001.

Konklusjoner protein og lipid kinaser formidler extracellulære signal intracellulært signalet ender som regel opp I kjernen med aktivering av transkripsjonsfaktorer reseptor stimulering aktiverer vanligvis multiple signalveier, med mulighet for gjensidig vekselvirkning, og ender opp med aktivering av flere typer transkripsjonsfaktorer