Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

Utledning av den genetiske koden Crick & Brenner 1961: Genetisk analyse av baktierofag T4-mutanter: Kodoner er tripletter Nirenberg 1961: Polynukleotid.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "Utledning av den genetiske koden Crick & Brenner 1961: Genetisk analyse av baktierofag T4-mutanter: Kodoner er tripletter Nirenberg 1961: Polynukleotid."— Utskrift av presentasjonen:

1 Utledning av den genetiske koden Crick & Brenner 1961: Genetisk analyse av baktierofag T4-mutanter: Kodoner er tripletter Nirenberg 1961: Polynukleotid fosforylase for syntese av polynukleotider. Poly(U) koder for poly-Phe. Nirenberg & Leder 1964: Trinukleotider stimulerer binding av aminoacyl-tRNA til ribosomer. Kodoner for de 20 aminosyrene Khorana: Syntese av repeterte polynukleotider. Den genetiske kode bekreftes. Stoppkodoner

2 Amino Acid Incorporation Stimulated by a Random Copolymer of U and G in Mole Ratio 0.76:0.24.

3 Aminoacyl-tRNA syntetaser Klasse I-motiver: HIGH og KMSKS, inngår i Rossman-folden Klasse II-motiver: Tre konserverte motiver som ligger i 7-trådet β-plate med tre flankerende helikser i kjernen av det katalytiske domene Klasse I må gjenkjenne antikodon, flere klasse II-enzymer interagerer ikke med antikodon. Klasse I aminoacylerer 2’OH i 3’ ende av tRNA, klasse II aminoacylerer 3’OH

4

5 tRNA-molekyl

6 Aminoacyl-tRNA

7 Hvilke tRNA-elementer gjenkjenner klasse I-syntetasen?

8 Viktige gjenkjenningselementer i fire tRNA

9 E. coli Gln-tRNA syntetase (klasse I) i kompleks med tRNA Gln og ATP

10 Asp-tRNA syntetase (klasse II) fra gjær i kompleks med tRNA Asp og ATP

11 Forskjeller i tRNA-binding mellom klasse I- og klasse II-syntetaser

12 Plasseringen av tRNA og aminoacyladenylat på enzymet bestemmer hvilken OH-gruppe som blir aminoacylert

13 Noen aminoacyl-tRNA syntetaser har korrekturlesingsaktivitet

14 Det eukaryote ribosom Fakta fra E.coli 20000/bakterie 2500 kD 250Å diam. 70S (30S + 50S) 2/3 RNA + 1/3 protein 80% av E.coli RNA 10% av E.coli-protein proteinsyntese

15 Sammensetning av E. coli- ribosomer

16 Sammensetning av cytoplasmatiske ribosomer fra rottelever

17 Ribosomale proteiner, E. coli S1-S21 og L1-L31 Nummerert etter vandring i 2D gel S20 og L26 er felles for subenhetene, sitter i kontaktpunktet L7/L12 samme protein +/- (N-term.) acetylering, 4 eks ialt + L10 = L8 Alle andre proteiner i 1 eksemplar Minste: L34, 46 aa. Største: S1, 557 aa. Liten sekvenshomologi mellom de ribosomale proteiner (52) Mye Lys og Arg, lite aromatiske aa (rRNA polyanionisk) RNA-recognition motif (RRM) i 5 proteiner RRM: 3 antiparallelle  -sheets med  -heliks mellom 2. og 3.

18 Ribosomale proteiner og rRNA assosierer uten hjelp, ”self-assembling units ” Start: S4, S8, S15, S17 Start: S4, S8, S15, S17

19 Hva gjør proteinene og rRNA Small subunit- binding mRNA binding: S1,S3,S4,S5, S9,S12,S18 +3’-enden av 16S rRNA Antikodon binding i ”cleft” Gjenkjenner og binder tRNA Large subunit - katalyse Peptidyltransferase : L2,L11,L15 L16, L18,L23,L S rRNA GTPase-stalk: 4 stk L7/L12 Peptidyltransferase i ”valley” Membran assosiering: ved utgang av peptidkanal

20 Eukaryote vs. prokaryote Like i struktur og funksjon - ulike i nesten alle detaljer –Varierende sekvens Eukaryote ribosomer er: –Mye større, 80S 40S + 60S, struktur som prokaryoter –Flere og større rRNA 40S: 18S rRNA 60S: 28S, 5,8S, 5S rRNA –Flere proteiner Liten subenhet: 33 proteiner Stor subenhet: 49 proteiner

21 antikodonbinding Peptidyl- transferase Peptidyl- transferase Polypeptidutgang Kanal: 25 X Å Polypeptidutgang Kanal: 25 X Å Liten subenhet Stor subenhet

22 E. coli-ribosomet, 25Å oppløsning

23

24 Wobble-hypotesen 61 aminosyre-kodoner tRNA Mange tRNA binder flere kodon Wobble-hypotesen: de to første basepar binder stringent, mens det siste tillater non-Watson-Crick baseparring (U:G, I:A) Antikodon 3’ A----A----Gm 5’ antiparallell binding kodon 5’ U----U----C/U 5’ Gm (2’-metylguanosin) eller inosin er vanlig i antikodon

25 To ”wobble”-basepar, begge bekreftet ved strukturbestemmelse

26 Tillatte wobble-basepar

27 Puromycin sammenlignet med tyrosyl-tRNA

28 Foreslått mekanisme for ribosomal peptidsyntese

29 Modell av peptidyl transferase-senteret i ribosomet med substrat bundet til A- og til P-setet

30 Translasjonsinitiering hos E. coli 1.IF-3 fremmer dissosiasjon av 70S- ribosomet. IF-1 stimulerer dissosiasjonen, kanskje ved å bidra til binding av IF-3 2.mRNA og IF-2 i ternært kompleks med GTP og fMet-tRNA f Met bindes til 30S 3.IF-3 frigis. 50S bindes til 30S- initieringskomplekset. IF-2 hydrolyserer sitt GTP. Dette gir en konformasjonsendring i 30S, IF-1 og IF-2 frigis

31 Initiering -fMet Prokaryoter: fMet er første aa, metionin er formylert på NH 2 -gruppen Eukaryoter: AUG - prokaryoter: AUG, GUG fMet-tRNA f Met : samme syntetase for tRNA f Met og tRNA m Met Formylering skjer etter tRNA kopling Enzymet er spesifikt for Met-tRNA f Met N 10 -formyltetrahydrofolat er metyldonor fMet deformyleres eller fjernes helt post-translasjonelt

32 tRNA f Met, forskjeller sammenlignet med normalt tRNA

33 Translasjonsinitiering hos pattedyr: minner om prokaryot initiering, men mer komplisert

34 Initiering – prokaryoter vs. eukaryoter Prokaryot IF-1, IF-2, IF-3 fMet Shine-Delgarno sekvens Mono- and polycistronisk mRNA Proteinstart ved definert AUG –Kan translatere sirkulært mRNA Eukaryot eIF-n, n>10 Ingen fMet Ingen Shine-Delgarno Monocistronisk mRNA Proteinstart = første AUG –Kan ikke translatere sirkulær mRNA –eIF-4E er cap-bindende protein, som hjelper 40S å starte scanning av mRNA

35 Ribosombindingssekvenser i prokaryot mRNA (Shine-Delgarno-sekvenser)

36 Forlengelsessyklus for E. coli - ribosomer (E-setet ikke vist)

37 Peptidforlengelse, skjematisk

38 Elongering - EF-Tu’s rolle Øker hastigheten i amino-tRNA binding - koster GTP Forlater aa-tRNA komplekset når det sitter i A-setet bundet til kodon på mRNA Utgjør 5% av E.coli protein, ca /bakterie ”Alle” aa-tRNA er bundet til EF-Tu/GTP EF-Tu/GDP regenereres: EF-Ts erstatter GDP og GTP erstatter EF-Ts Binder ikke tRNA f Met med Met eller fMet pga manglende basepar i aminoarmen

39 Regenerering av EF-Tu Tilhører familien av GTP-bindende proteiner Felles strukturelt motiv som: – binder GTP/GDP – hydrolyserer GTP Aktivitet avhengig av –GTPase aktiverende protein (GAP) - for EF-Tu er det ribosomet. GTP hydrolyse => stor konformasjonsendring i EF-Tu –guaninnukleotid-frigjøringsfaktor (GRF)- for EF-Tu er det EF-Ts

40 Elongering - 3-trinns syklus Binding (decoding), transpeptidering, translokasjon 40 aminosyrer inkorporert/sekund Ikkeribosomale elongeringsfaktorer:EF-Tu, EF-Ts, EF-G GTP hydrolyseres til GDP ved binding og translokasjon

41 Translokering - 2-trinns prosess Tom tRNA overføres til E-setet E P A Peptidyl-tRNA overføres fra A- til P-setet Non-ribosomal elongeringsfaktor: EF-G EF-G bindes i kompleks med GTP EF-G/GTP binding hindrer EF-Tu/GTP binding Fjerning av EF-G/GTP krever hydrolyse av GTP og er samtidig startsignal for binding av ny aa-tRNA i A-setet EF-G tilhører familien av GTP-bindende proteiner, men er sin egen GRF

42

43 Termineringsreaksjonen i E. coli-ribosomer RF-1 gjenkjenner UAA og UAG RF-2 gjenkjenner UAA og UGA Hos eukaryoter bindes en enkelt frigjøringsfaktor, eRF, til ribosomet sammen med GTP

44 Prokaryot vs. eukaryot Prokaryot RF-1, RF-2, RF-3(GTP) Eukaryot eRF(GTP)

45 Frigjøringsfaktorene ligner på tRNA men bindes ikke nødvendigvis til ribosomet på en måte som utnytter likheten…

46 Hva er GTP’s funksjon Hastighet Translasjon kan finne sted uten GTP - svært langsom IF-2/GTP, EF-Tu/GTP, EF-G/GTP, RF-3/GTP Ingen høy-energi intermediater Binding av GTP-bindende proteiner m/GTP til ribosomet => allosterisk forårsaket konformasjonsendring –GTP => konformasjonsendring –GDP + Pi => avslapning GTP hydrolysen er rask og irreversibel => tilknyttede reaksjoner blir det også

47 Hva er GTP’s funksjon Nøyaktighet Kinetisk feilsøking Binding skjelner mellom ”cognate” og ”non-cognate” kodon-antikodon interaksjon vha bindingsenergi GTP hydrolyseres, danner GDP intermediat med diss. konstant k 3 Non-cognate k 4 antas > cognate k 4 Hvis k 3 >k 4 => peptidbinding lages Hvis k 4 >k 3 => ingen peptidbinding


Laste ned ppt "Utledning av den genetiske koden Crick & Brenner 1961: Genetisk analyse av baktierofag T4-mutanter: Kodoner er tripletter Nirenberg 1961: Polynukleotid."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google