Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays) Ivo Nentwich IMTRA, Ahus.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays) Ivo Nentwich IMTRA, Ahus."— Utskrift av presentasjonen:

1 Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays) Ivo Nentwich IMTRA, Ahus

2 2 Immunometriske analyser (immunoassays) •Subgruppe av immunologiske teknikker •Spesifikk binding mellom antigen-spesifikt antistoff som er markert (“labelling”) •Reaksjonen visualiseres vha målbart signal (enzym, radioaktiv, fluorescens, chemiluminiscens..) •Signalet måles med tilsvarende deteksjonssystem

3 3 Immunometriske analyser (immunoassays) •EIA - ELISA og modifikasjoner (Elia, ImmunoCap) •Dot Blot, Line-blot, Western blot, multiplex immunoassays •ELISPOT •Radiometriske metoder (RIA, radiobinding assay, RAST) •Immunfluorescens

4 4 Immunometriske metoder •Generelt skjema for immunoanalyser

5 5 Immunoanalyse karakteristikker Kriterium beskrivelse 1. Separasjonstrinnheterogen = med separasjonstrinn homogen = ingen separasjon 2. SeparasjonsmetodeLøsning eller væskefaseFast fase 3. Kjemi av bindingKompetitiv (markert+umarkert reag.) Samtidig tilsetning av reagenser Suksessiv tilsetning av reagenser Ikke-kompetitiv 4. Markering av reagensAntigen markertAntistoff markert 5. Type av markeringRadioaktiv isotop [radionuklid: H3, C14, I125, S32…] Enzym: Horseradish peroxidase Alkaline phosphatase β-Galactosidase Fluorofor Luminofor Mange andre….. 6. KalibreringsmodusHomolog standardkurve (antigen) heterolog referansekurve (antistoff)

6 6 Markeringssystemer •Enzymer (HRP pepperrot peroxidase, AP…) •Enzymer med fluorescent deteksjon (FEIA) •Enzymer med kjemiluminiscens deteksjon (Immulite) •Radioaktive isotoper (I 125, S 35, P 32 …) •Fluorokromer – FITC, PE…. •Gull, sølv..

7 7 Immunometriske teknikker for påvisning av antistoff (indirekt metode)

8 8 Påvisning av antigen (sandwich ELISA) •Antistoff bundet på fast fase

9 9 Påvisning av antigen (sandwich ELISA)

10 10 ELISA - plate

11 11 ELISA, RIA – litt om histori •RIA (Yalow, Berson 1960) •Helsefarlig stråling •Utvikle kobling mellom antistoff og enzym (Avrameas, Pierce) •Utvikling av immunosorbent (Wide, Porath 1966) •1971 Perlmann, Engvall – SE, Schuurs – NL publiserte den nye EIA/ELISA

12 12 Phadia Elia •Anti-IgG/A/M – enzymmarkert (beta-galaktosidase) •Methylumberliferyl-B-D-galaktosid •Stopping av enzymreaksjon •Fluorescens-måling ved 445 nm

13 13 Dot blot •Direkt påføring av antigen på nitrocellulose membran •Preinkubasjon (blokkering) •Inkubasjon med antistoff mot antigen vi leter etter (antigenpåvisning) •Inkubasjon med pasientens serum •Markert antistoff (enzym, radioaktiv…)

14 14 Dot blot •Resultat •Deteksjon – enzym, radioaktiv (film), kjemiluminiscens (film)

15 15 Line-blot •Påvisning av antistoff •Kjent renset antigen (oftest rekombinant) •Inkubasjon med pas. serum •Deteksjon – oftest enzym – kvantitativt, semikvanitativt, densitometri •Radioaktiv, ECL (kjemiluminiscens)

16 16 Western blot - immunoblot •Deteksjon av antistoff mot ukjente antigen/allergen •SDS-PAGE med halv-tørr (semi-dry) blotting teknikk

17 17 Western blot - immunoblot •Antigenene delt etter molekylvekt •Inkubasjon med serum, vasking, antistoff •Deteksjon kvalitativt, semikvantitativt eller kvantitativt (densitometri)

18 18 ELISPOT •Produksjon av substanser på single- cell-level •Mest til påvisning av cytokiner, antistoff

19 19 ELISPOT – modifikasjoner med fluorokromer

20 20 ELISPOT - resultat Typical Areas of ELISpot assays •Characterization oh the TH1/TH2 response •Vaccine Development •Infectious diseases, i.e. HCV •Therapy monitoring •Epitope mapping •Autoimmunity •Transplantation

21 21 Radioimmunoassay RIA •Klassisk metode •Kompetitiv likvidfase analyse •separasjontrinn

22 22 Radioimmunosorbent analyser Kompetitiv binding radioimmunoanalyse Non-kompetitiv immunoradiometrisk analyse Non-competitive (two-site) immunoradiometric assay (IRMA) Likner sandwich ELISA

23 23 RAST – klassisk etterfølger av RIA •1974 Pharmacia Sverige •IgE antistoff mot allergener •1989 erstattet av ImmunoCap (CAP RAST, CAP Feia) •Modifikasjon – paper radioimmunosorbent test PRIST – ikke routinemessig i bruk

24 24 Phadia ImmunoCap •FEIA (fluoroenzymoimmunoas say) •Spesifikk IgE testing – type I allergi

25 25 ImunoCap ISAC mikrochip •Miniaturisert immunoassay platform muliggjør multianalyse av spesifikk antistoff IgE, IgG, IgG4 mot flere allergenkomponenter •20 μl of serum / plasma •Rensede eller rekombinante allergenkomponenter på fast fase (biochip) •Inkubasjon, vasking •Fluorokrom-markert anti-humant IgE antistoff •biochip scanner, software nødvendig •semikvantitativ test: ISAC Standardized Units (ISU) •Dyrt, semikvantitativt, vanskelig å interpretere, ikke fleksibelt – fast kombinasjon av 113 allergener

26 26 Analyser av multiple antistoff – multiplex immunoassay •Polystyren mikrokuler impregnert med varierende proporsjoner av to ulike fluorokromer •Familie av mikrokuler med unik fluorescens markering •Koblet med antigen •Inkubering, vask, markert antistoff •Deteksjon – simultant hver mikrokul og bundet markert antistoff •Brukes bl.a. til påvisning av antinukleære antistoff

27 27 Immunometriske metoder

28 28 Immufluorescens •Direkte IF DIF (påvisning av bundet antigen i veven) •Indirekte immunfluorescens IIF (påvsning av antistoff) •Mikroskopisk preparat av celler/vev.. •Inkubering med serum •Vasking, anti-IgG-FITC •Avlesing vha fluorescensmikroskop, titer rapporteres •Eksempel: •ANCA/ANA – multiblokk •Indirect fluorescent antiboty test (IFAT)

29 29 Takk fra Ahus


Laste ned ppt "Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays) Ivo Nentwich IMTRA, Ahus."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google