Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays)

Presentasjon om: "Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays)"— Utskrift av presentasjonen:

1 Immunologiske teknikker Immunometriske analyser (immunoassays)
Ivo Nentwich IMTRA, Ahus

2 Immunometriske analyser (immunoassays)
Subgruppe av immunologiske teknikker Spesifikk binding mellom antigen-spesifikt antistoff som er markert (“labelling”) Reaksjonen visualiseres vha målbart signal (enzym, radioaktiv, fluorescens, chemiluminiscens..) Signalet måles med tilsvarende deteksjonssystem

3 Immunometriske analyser (immunoassays)
EIA - ELISA og modifikasjoner (Elia, ImmunoCap) Dot Blot, Line-blot, Western blot, multiplex immunoassays ELISPOT Radiometriske metoder (RIA, radiobinding assay, RAST) Immunfluorescens

4 Immunometriske metoder
Generelt skjema for immunoanalyser

5 Immunoanalyse karakteristikker
Kriterium  beskrivelse 1. Separasjonstrinn heterogen = med separasjonstrinn homogen = ingen separasjon 2. Separasjonsmetode Løsning eller væskefase Fast fase 3. Kjemi av binding Kompetitiv (markert+umarkert reag.) Samtidig tilsetning av reagenser Suksessiv tilsetning av reagenser Ikke-kompetitiv 4. Markering av reagens Antigen markert Antistoff markert 5. Type av markering Radioaktiv isotop [radionuklid: H3, C14, I125, S32…] Enzym: Horseradish peroxidase Alkaline phosphatase β-Galactosidase Fluorofor Luminofor Mange andre….. 6. Kalibreringsmodus Homolog standardkurve (antigen) heterolog referansekurve (antistoff)

6 Markeringssystemer Enzymer (HRP pepperrot peroxidase, AP…)
Enzymer med fluorescent deteksjon (FEIA) Enzymer med kjemiluminiscens deteksjon (Immulite) Radioaktive isotoper (I125, S35, P32…) Fluorokromer – FITC, PE…. Gull, sølv..

7 Immunometriske teknikker for påvisning av antistoff (indirekt metode)

8 Påvisning av antigen (sandwich ELISA)
Antistoff bundet på fast fase

9 Påvisning av antigen (sandwich ELISA)

10 ELISA - plate

11 ELISA, RIA – litt om histori
RIA (Yalow, Berson 1960) Helsefarlig stråling Utvikle kobling mellom antistoff og enzym (Avrameas, Pierce) Utvikling av immunosorbent (Wide, Porath 1966) 1971 Perlmann, Engvall – SE, Schuurs – NL publiserte den nye EIA/ELISA

12 Phadia Elia Anti-IgG/A/M – enzymmarkert (beta-galaktosidase)
Methylumberliferyl-B-D-galaktosid Stopping av enzymreaksjon Fluorescens-måling ved 445 nm

13 Dot blot Direkt påføring av antigen på nitrocellulose membran
Preinkubasjon (blokkering) Inkubasjon med antistoff mot antigen vi leter etter (antigenpåvisning) Inkubasjon med pasientens serum Markert antistoff (enzym, radioaktiv…)

14 Dot blot Resultat Deteksjon – enzym, radioaktiv (film), kjemiluminiscens (film) 1 2 3 4 1 2 3 4

15 Line-blot Påvisning av antistoff
Kjent renset antigen (oftest rekombinant) Inkubasjon med pas. serum Deteksjon – oftest enzym – kvantitativt, semikvanitativt, densitometri Radioaktiv, ECL (kjemiluminiscens)

16 Western blot - immunoblot
Deteksjon av antistoff mot ukjente antigen/allergen SDS-PAGE med halv-tørr (semi-dry) blotting teknikk

17 Western blot - immunoblot
Antigenene delt etter molekylvekt Inkubasjon med serum, vasking, antistoff Deteksjon kvalitativt, semikvantitativt eller kvantitativt (densitometri)

18 ELISPOT Produksjon av substanser på single-cell-level
Mest til påvisning av cytokiner, antistoff

19 ELISPOT – modifikasjoner med fluorokromer

20 ELISPOT - resultat Typical Areas of ELISpot assays
Characterization oh the TH1/TH2 response Vaccine Development Infectious diseases, i.e. HCV Therapy monitoring Epitope mapping Autoimmunity Transplantation

21 Radioimmunoassay RIA Klassisk metode Kompetitiv likvidfase analyse
separasjontrinn

22 Radioimmunosorbent analyser
Kompetitiv binding radioimmunoanalyse Non-kompetitiv immunoradiometrisk analyse Non-competitive (two-site) immunoradiometric assay (IRMA) Likner sandwich ELISA

23 RAST – klassisk etterfølger av RIA
1974 Pharmacia Sverige IgE antistoff mot allergener 1989 erstattet av ImmunoCap (CAP RAST, CAP Feia) Modifikasjon – paper radioimmunosorbent test PRIST – ikke routinemessig i bruk

24 Phadia ImmunoCap FEIA (fluoroenzymoimmunoassay)
Spesifikk IgE testing – type I allergi

25 ImunoCap ISAC mikrochip
Miniaturisert immunoassay platform muliggjør multianalyse av spesifikk antistoff IgE, IgG, IgG4 mot flere allergenkomponenter 20 μl of serum / plasma Rensede eller rekombinante allergenkomponenter på fast fase (biochip) Inkubasjon, vasking Fluorokrom-markert anti-humant IgE antistoff biochip scanner, software nødvendig semikvantitativ test: ISAC Standardized Units (ISU) Dyrt, semikvantitativt, vanskelig å interpretere, ikke fleksibelt – fast kombinasjon av 113 allergener

26 Analyser av multiple antistoff – multiplex immunoassay
Polystyren mikrokuler impregnert med varierende proporsjoner av to ulike fluorokromer Familie av mikrokuler med unik fluorescens markering Koblet med antigen Inkubering, vask, markert antistoff Deteksjon – simultant hver mikrokul og bundet markert antistoff Brukes bl.a. til påvisning av antinukleære antistoff

27 Immunometriske metoder

28 Immufluorescens Direkte IF DIF (påvisning av bundet antigen i veven)
Indirekte immunfluorescens IIF (påvsning av antistoff) Mikroskopisk preparat av celler/vev.. Inkubering med serum Vasking, anti-IgG-FITC Avlesing vha fluorescensmikroskop, titer rapporteres Eksempel: ANCA/ANA – multiblokk Indirect fluorescent antiboty test (IFAT)

29 Takk fra Ahus