Transkripsjon i eukaryoter

Presentasjon om: "Transkripsjon i eukaryoter"— Utskrift av presentasjonen:

1 Transkripsjon i eukaryoter
Voet & Voet kapittel 33 + litt supplement Lagt på nett:

2 Oversikt RNA polymerase I RNA polymerase III RNA polymerase II
proteinfaktorer og promoter/gen-organisering RNA polymerase III RNA polymerase II Kromatin som medspiller 80% av total RNA syntese fra disse ”Oddpols”

3 RNA polymerase I (RNAPI)

4 Klasse I gener (rRNA) transkribert av RNA polymerase I (RNAPI)
RNAPI syntetiserer kun en type RNA: ribosomalt RNA En trx enhet (7.5 kB) Multiple tandem gener for å øke rRNA produksjonen x avh av species

5 Nucleoli RNAPI lokalisert til nucleoli (ribosom-fabrikker)

6 Klasse I gener (rRNA): promoter-organisering
Repeterte gener med promotere imellom Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter Core UPE Terminator elementer Enhancere

7 Klasse I gener (rRNA): Hjelpefaktorer involvert
Repeterte gener med promotere imellom Intergenisk spacer (IGS) med terminator+promoter UBF UBF SL1 TTF-1 RNAPI Core UPE Terminator elementer Enhancere

8 RNA polymerase III (RNAPIII)

9 Klasse III gener transkribert av RNA polymerase III
RNAPIII syntetiserer et fåtall ulike RNA som er små, stabile og ikke-translaterte tRNA, 5S RNA, 7SL RNA, U6 snRNA ++

10 Promotere - tre typer Typer promotere
Type I: som i 5S rRNA genet, A-I-C blokker Type II: som i tRNA genene, A+B blokker Type III: atypiske uten intrageniske elementer A I C A B

11 Klasse III gener transkribert av RNA polymerase III
Promotere med intrageniske elementer Mutasjoner endrer både promoter og produkt Polymerasen må lese igjennom aktiverende trx-komplekser A-blokk B-blokk

12 Klasse III gener: hjelpefaktorer involvert
Type II promotere - mest klassiske Sekvens: TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC A B TFIIIB TBP

13 Klasse III gener: hjelpefaktorer involvert
Type I promotere en type gen, en spesial faktor TFIIIA Sekvens: TFIIIA - TFIIIC - TFIIIB/TBP - RNAPIII RNAPIII TFIIIC TFIIIA A I C TFIIIB TBP

14 RNA polymerase II (RNAPII)

15 Understanding transcription - Increasing complexity
80ties 70ties 90ties Today Lemon and Tjian 2000 Genes Dev. 14:

16 Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II
Mediator Signal RD RNAPII TF TAD TFIID DBD Transcription factors TBP Chromatin GTFs TATA Enhancer Promoter Nucleosomal template - chromatin modifying activities

17 Språket: cis-elementene

18 cis-elementenes funksjon = Templater for kompleksdannelse
The function of cis-elements is being templates for the assembly of multiprotein complexes

19 Promoter organisering
core promoter upstream regulatoriske element Enhancere Boundary elements LCR - locus control regions Promoter organisering

20 Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II
Subklasser RNAPII-promotere mRNA-kodende TATA+ INR+ både TATA og INR uten TATA, uten INR snRNA-kodende

21 Noen typer cis-elementer
UPE - Upstream promoter elementer Binder konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler Lokalisert nær TATA/INR (innen ca. 200 bp) Eksempler CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) GC-rike bokser - binder Sp1 Regulatoriske elementer 1. Responsive elementer eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heast shock, glucocorticoider 2. Celletype spesifikke elementer Lokalisert innblandet med UPE

22 Enhancere Distale elementer - Enhancere
Øker kraftig aktiviteten av en promoter virker over lang avstand, uavh. av orientering, upstream/downstream Drosophila wing margin enhancer: 85 kb upstream TSS Immunoglobulin Hm enhancer: i 2. Intron T-cell receptor a-chain enhancer: 69 kb downstream samme cis-elementer som proksimalt multiple cis-elementer innen et lite område (50 bp kb) cis-elementer for mange ulike faktorer responsive/vevsspes avh av sammensetning

23 Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II
TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

24 RNA polymerase II Core med aktivt sete RPB1 (´-like)binder DNA
 Prokaryot  RNA polymerase II  ´  Eukaryot DNA-bindende Core med aktivt sete RPB1 (´-like)binder DNA RPB2 (-like) binder NTP RPB3 (-like) assembly factor Felles subenheter RPB5, 6 og 8 felles for RNAPI-III Til forskjell fra prokaryot RNAP, er RNAPII ikke i stand til spesifikk promoter-gjenkjenning NTP-binding

25 CTD - ”C-terminal domain”
Hale på største subenhet: (YSPTSPS)n n = 26 i gjær, 52 human pol.II hydrofil eksponert hale Unik for RNAPII Essensiell funksjon in vivo  >50% letalt

26 CTD- funksjon Fosforylering: (YSPTSPS)n
Reversibel fosforylering på både Ser og Tyr Fosforylering endres gjennom trx syklus Kinasering skjer etter PIC assembly defosforylering av fri pol eller ved terminering

27 Fosforylerings-syklus

28 CTD funksjon Initiering Promoter clearance Elongering
Rolle i “recruitment” av RNAPII til promoter bare ufosforylert pol deltar i PIC-assembly Promoter clearance RNAPII går over i hyperfosforylert elongeringsmodus CTD fosforylering bryter interaksjoner og RNAPII frikobles fra PIC Elongering Samtidig: CTD fosforylering danner nye interaksjoner med elongeringsfaktorer En rekke nye CTD-bindende proteiner identifisert siste år med funksjoner i splicing og terminering Tett kobling: transkripsjon - pre-mRNA prosessering

29 CTD binder også en rekke faktorer
Holoenzym = Mediator + core RNAPII Mediator RNA processering RNAPII = ”mRNA factory” som utfører koblet transkripsjon, capping, splicing og prosessering av 3´-ende

30 Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II
TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

31 GTFs - generelle transkripsjonsfaktorer
Hjelpefaktorer som dirigerer RNAPII til promoter Trinnvis assembly Dannelse av PIC - pre-initiation complex

32

33 1. Trinn: TATA bindes av TBP
TBP binder TATA - sekvensgjenkjenning minor groove kontakt TBP binder også en rekke andre polypeptider aktivatorer TAFs (kalles da TFIID = TBP + TAFs) GTFs (TFIIB, TFIIA) TBP = universell TF involvert i alle 3 tr.systemene TBP i SL1, TFIID, TFIIIB protein DNA

34 TBP = sadel (med TATA som hest)
3D: Sadel-struktur Konkav innerside binder DNA i minor groove via 10-stranded antiparallelt b-sheet Konveks overside binder prot via 4 a-helikser stigbøyler (“stirrup”) på hver ende

35 TBP bøyer DNA (stakkars hest)
Ikke slik, …….men slik

36 RNA polymerasen gjenkjenner en GTF-bundet promoter
TBP TFIIA TFIIB Dette protein-promoter komplekset er det som gjenkjennes av RNAPII

37 PIC ”modnes” etter RNAPII binding
TFIIH: multisubenhet med CTD-kinase + helicase for smelting

38 Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II
TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

39 PIC-dannelse stimuleres av transkripsjonsfaktorer
Dannelse av PIC styres av TFs som binder elementer oppstrøms Aktivatorer med høy sekvens-spesifisitet Rekrutteringspunkt for assembly av komplekser

40 (Oppstrøms) Transkripsjonsfaktoer
TAD DBD N C Modulær oppbygning - iallfall 2 domener: 1. DBD - DNA-bindingsdomene 2. TAD - transaktivatordomene DBD: grunnlaget for gruppering i TF-familier Sinkfingre, kjernereseptorer, helix-loop-helix, leucin-zippere,osv. TAD ulike grupper Tre klasser med ulike targets sure domener (GAL4, steroid receptor) glutamin-rike domener (Sp1) prolin-rike domener (CTF/NF1) Strukturløse i fri tilstand - 3D i kontakt med target?

41 Mange ulike TFs Konstitutive TFs Regulatoriske TFs
Konstitutivt uttrykte faktorer som finnes i alle celler Binder cis-elementer lokalisert nær TATA/INR Eksempler CCAAT boks - binder ulike TFs (CTF/NF-I, CBFINF-Y) GC-rike bokser - binder Sp1 Regulatoriske TFs 1. Signal-responsive faktorer eks.: CRE, HSE, GRE - medierer respons overfor cAMP, heat shock, glucocorticoider 2. Celletype spesifikke faktorer

42 Konstitutive Sp1 binder GC-bokser
Noen eksempler

43 Synergi - mange faktorer stimulerer bedre enn én alene
Mange kontakter gir mer effektiv PIC assembly

44 Familier - oppdelt etter DBD struktur
Zinc finger bHelix-Loop-Helix (Max) STAT dimer Leucine zipper (Gcn4p) p53 DBD NFkB

45 Familie Sinkfinger proteiner
TFIIIA fra Xenopus var første isolerte og klonede eukaryote TF Funksjon: aktivering av 5S RNA transkripsjon Primærstruktur TFIIIA Bygget opp som repetisjon 9x 30 aa minidomener + 70 aa unik region C-term Hvert minidomene konservert mønster av 2Cys+2His Hvert minidomene strukturert rundt et koordinert sink ion

46 Sinkfinger proteiner Sink koordineres av 2 Cys + 2 His
Antall fingre varierer: 2-37 Antall medlemmer uvanlig mange S.cerevisiae genomet: 147 C.elegans genomet 535 Flere hundre humane Zif gener

47 3D struktur av sinkfingre
Zif268 - første multi-finger struktur Hver finger et minidomene med -struktur major groove kontakt via -heliks i  gjenkjenning av base tripletter

48 Kjerne-reseptorer - en sinkfinger-variant
To ”sinkefingre” utgjør en samlet enhet En finger kontakter DNA Dimeriserer ved binding til DNA

49 Kjernereseptorer Stor familie hvor DBD binder 2 Zn++ via tetraedrisk mønster av Cys Konservert DBD aa Medierer transkripsjonell respons på komplekse ekstracellulære signal klassiske steroid hormoner sekretert fra endokrine celler  via blod  målcelle  diffusjon inn  binder reseptor  aktiveres  modulerer målgener Evolusjonsmessig koblet til multicell.org

50 Gal4p - enda en sinkfinger variant (6 Cys + 2 Zn)

51 Leucin zipper - nesten glidelås
60-80 aa motiv funnet i en rekke dimere TFs Prototypiske eks.: GCN4, Fos, Jun, C/EBP, ATF, CREB mange mulige dimer-partnere gir tallrike kombinasjoner Dimer-dannelse via parallell coiled coil av a-helikser (ZIP) Hver 7.aa = Leu 3.5 aa pr turn (coiled coil) hver 7.aa lik posisjon Alle Leu samme side og dimerisering via “leucine zipper”

52 Leucin zipper - nesten glidelås
Dimer via parallell coiled coil av a-helikser Hver 7.aa = Leu 3.5 aa pr turn (coiled coil) hver 7.aa lik posisjon Alle Leu samme side og dimerisering via “leucine zipper”

53 Kontakter DNA som en pinsett

54 HLH - helix-loop-helix - lignende variant med brutte helikser

55 Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II
TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

56 Koaktivatorer - brobyggere som også gir kromatin remodelering
remodellering

57 En rekke coaktivatorer og corepressorer deltar

58 Klasse II gener transkribert av RNA polymerase II
TATA TFIID TBP TF RNAPII Mediator GTFs Chromatin Signal

59 Kromatin Kromatin - et nukleoprotein kompleks
bevirker kondensasjon og organisering av DNA protein:DNA = 2:1 masseforhold histon:DNA = 1:1 masseforhold ulike kondensasjonsgrader 10 nm utstrakt fiber med nukleosom-perler (7x compaction) 30 nm kondensert fiber (40-50x compaction)

60 Grunnenhet - nukleosomer
Repetert enhet i kromatin Repeat lengde: bp Nuklease fordøying litt m.nuklease: oligo-nukleosomer mer m.nuklease: kromatosom m/ 166bp DNA + octamer + H1 enda mer m.nuklease: core partikkel 146 bp DNA + octamer DNA venstredreid superheliks 2 turns rundt

61 Nukleosomene består av histoner
Fem klasser histoner H2A H2B H3 H4 H1 Basiske proteiner Lignende 3D fold

62 Histoner - ekstremt konserverte
Kalver eller erter - nesten det samme

63 Oktamer partikkel Octamer = (H2A, H2B, H3 og H4)2
Assembly: H3-H4 tetramer  +2 H2A-H2B dimere Krystallstruktur (low resolution 1984, high resolution 1997) C-terminal: globulær mens N-terminal: ustrukturerte fleksible haler (tails) basiske haler antas inngå i DNA-kontakt basiske haler involvert i internukleosom interaksjon sete for posttranslasjonell modifisering (acetylering)

64 DNA kveiles rundt på utsiden

65 3D struktur av nukleosomer

66 H1 ved inngang/utgang H1 linker histon
assosisert med linker DNA mellom nukleosomer (ca. 1 stk H1 pr nukleosom) binder DNA entry/exit fremmer folding 10nm  30 nm fiber repressiv effekt på transkripsjon

67 H1 bidrar til videre pakking

68 Høy pakkegrad Nukleosomer - 7x H1-mediert 300Å filament - 40x
Videre pakket opp til 8000x

69 Flere nivå av pakking 2 m DNA er i kjernen pakket ned til en diameter på mm.

70 Hvordan påvirker kromatin transkripsjon? .. som repressor
Chromatin maintains a restrictive ground state by blocking association between Pol II basic transcription machinery and DNA while permitting many activators to bind to their target sites. TFIID TBP Activator

71 Transkripsjonsfaktorer fremmer PIC dannelse + åpning av kromatin
Enzymes that covalently modify the nucleosomal histones ATP-dependent chromosomal- modifying enzyme

72 To måter å åpne kromatin på
1. Åpning av kromatin via dirigert acetylering Histon-modifisering via HAT aktivitet 2. Åpning av kromatin via dirigert nukleosom mobilisering ATP-avhengig prosess

73 Halene på histonene modifiseres som signaler til transkripsjon
Acetylation Methylation Phosphorylation Ubiquitination ADP-ribosylation

74 Topologi Selv åpnet kromatin er en topologisk utfordring for RNAPII