Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner Elektroforese Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner

Begreper Elektroforese; separasjon av ladede løste komponenter/partikler i en løsning under påvirkning av et elektrisk felt Iontoforese (små molekyler / ioner) Sone-elektroforese (protein, DNA) Elektroferogram (densitometri) Amfolytt

Amfolytt - +

Vandring i et elektrisk felt Molekylets netto ladningen er avhengig av pH (amfolytter) Vandringshastigheten er proporsjonal med netto ladning, og omvendt proporsjonal med størrelse og viskositet Q μ = 6 · π · r · η

Skjematisk elektroforese-oppsett Elektrisk feltstyrke Molekylets beskaffenhet Bufferen Støttemedium Temperatur og fordamping

Det elektriske feltet Ohms lov: U = R · I Effekt: E = U · I Elektrisk feltstyrke: F = U / L [Volt/cm] Varmeutvikling: U · I · t Konstant spenning / strømstyrke / effekt / pulsed-field

Bufferen Bufferionene ”bærer” strømmen pH; bestemmer molekylenes total-ladning Ionestyrke og konsentrasjon; bestemmer migrasjonsrate og oppløsning Valens og ionestørrelse Viskositet

Jo høyere ionestyrker, desto større ionesky => lavere migrasjonshastighet og høyere oppløsning, men større varmeutvikling.

Påsetting av prøve på gel Submarin applisering ”Loading”-buffer Applisering på gel

Støttemedium; ønskede egenskaper: Ikke påvirke mobiliteten til buffer-ionene Stabilisere stor væskemengde i mediet Ikke være løselig i bufferen Inert for prøvemolekylene Porestørrelse tilpasset ønsket separasjon Homogen struktur Lavt egenpotensiale; elektroosmotisk flow

Elektroosmotisk flow / Elektroendosmose Buffer Protein + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + - + + - + - + - + + - + - + - + + - + - + - + + - + + - - + + + - + - + + + - + - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Katode Anode - - - + - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Overflate på en geltråd

Separasjonsbetingelse Molekylets ladning / masse ratio Molekylstørrelse vs. porestørrelse Gelmaterialer Agarose Polyakrylamid PAGE (Stivelse, celluloseacetat, papir)

Agarose Store porer ved 0,5 – 1 % agarose Ladning/masse-ratio Klar Lite elektroendosmose Egnet for proteiner og for DNA-fragment (< 20 kbp)

Polyakrylamid Kjemisk inert Nærmest ingen elektroendosmose Klar Termostabil Porestørrelse etter behov Ladning/masse-ratio og molekylstørrelse Egnet for små DNA-fragment (<1 kbp) og denaturert protein (SDS-PAGE) NB! Monomeren er svært giftig

«Native» elektroforese Elektroforese under denaturerende betingelser

Temperatur og fordamping

Liggende vs. stående gel

Visualisering ved gelelektroforese Fiksering Farging Avfarging Momenter å ta hensyn til: Diffusjon i gelen Spesifikk farge for det en ønsker visualisert Bakgrunnsfarge minst mulig Farges alle typer proteiner likt? Fargeopptak / fargeintensitet Egnethet for densitometri / deteksjon

Serumprotein-elektroforese Elektroforogram Agarose-gel

Spinalvæske- og serum- elektroforese Høyere oppløsning Mer sensitiv farge

Hemoglobin-elektroforese Ulik vandring ved forskjellig pH Ulike fargevalg pH 8,6 pH 4,5

Lipoprotein-elektroforese i serum Lipid-farge benyttet HDL VLDL LDL Chylomikroner

Elektroforetisk separasjon av DNA-fragmenter Farget med etidiumbromid Fluorescens fotografert Stige

Isoelektrisk fokusering Separasjon på ulik pI

Todimensjonal elektroforese (2D-elfo)

Kapillærelektroforese

- Kapillærelektroforese; + Kapillæret fylt med buffer; Separerer på ladning Katode - Anode +

- Kapillær gelelektroforese + Kapillæret fylt med polymer Separerer på størrelse Katode - Anode +

”Blotte”-teknikker Western blotting (protein + antistoff) Southern blotting (DNA + DNA-probe) Northern blotting (RNA + RNA-probe) 1. Elektroforese 2. Blotting 3. Spesifikk merking 4. Visualisering

Elektroforese

Blotting

Spesifikk merking og visualisering

Eksempel: Western blotting av celle- og tumorlysater, antistoffer mot fosforylert-Akt (rød) og total-Akt (grønn) fremkalt i NIR-skanner. 125 kD 100 83 59 44 37 25 20 15 7,5 Stige Αkt/p-Akt (60 kD)