Slektskapsanalyser av molekylærgenetiske data Andreas Radtke Smittevernoverlege St.Olavs hospital

Molekylærgenetiske metoder PFGE MLST MLVA AFLP SNP CRISPR … Helgenomsekvensering

Ernst Haeckel, 1866

Ned-opp eller opp-ned tre Kan være vanskelig å vite hvem som er grunnleggeren av en cluster Enklere å definere slektskap mellom par av stammer og definere opprinnelse derfra

Mikrobiologisk phylogeni Ingen tokogeni Mutasjon og genopptak som drivende Generasjonstid Egenskap A Egenskap B Stamme 1 x1 y0 Stamme 2 x0 y1

Typingens formål? Overvåkning av infeksjonssykdom Nasjonal og internasjonal Undersøkelse av et utbrudd Patogenese og forløp av en infeksjon Virulente og avirulente stammer Bakteriell populasjonsgenetikk Species eller subspeciesnivå Epidemiologisk konkordans Gir analysen et sant bilde av epidemiologien? Gjelder både metoden og analysen

Overveininger for en typing Tid og geografi Enklere å finne korrekt slektskap mellom stammer fra samme tid og geografisk område Bias i stammesamlingen? F.eks. stammesamling GBS fra storfe i Trøndelag

Oppløsningsevne av typingsmetoder Høy oppløslighet, stor datamengde, f.eks. hel-genom-sekvensering Lav oppløslighet, liten datamengde, f.eks. antibiogramm

Genetisk klokke og typingsmetoder Mål: utbruddsoppklaring hurtige forandringer/mutasjoner Bringe frem mest mulig diversitet  PFGE (, AFLP), MLVA Mål: epidemiologisk overvåkning Konserverte områder Mindre diversitet  MLST, MLVA?

Dynamikk av genomer Evolusjonær mutasjonsrate Mutasjonsrate av et gen kjent? Isersjon/delesjon av sekvenser gir «hopp» i evolusjonen Plasmider

Monomorphe species Lav diversitet i sequensen Gir lav oppløsning i en rekke metoder, f.eks. MLST Viktige monomorfe species: M.tuberculosis Y.pestis B. anthracis Salmonella enterocolica (serovar thyphi) M. leprae

Interpretasjon av DNA fragmentmønster F.eks. PFGE Antall bånd Prosentuell likhet av mønstrene Mutasjoner må være i restriksjonsområde for å gi forskjell

Interpretasjon av PFGE (etter Tenover) Ingen forskjell 1-4 bånds forskjell: nært beslektet 5-8 bånds forskjell: mulig beslektet …men hvor mange mutasjoner ligger bak? Best å ha 10-15 bånd valg av restriksjonsenzym Tenover et al, J Clin Microbioll, 1995, 2233ff

Analyse av MLVA profiler Populasjonsanalyser kan indikere mutasjonsraten i repetisjonsområder Mutasjonsmønster kjent? Stegvis mutasjon mot tilfeldig Mutasjoner kan forekomme under et utbrudd

Interpretasjon av data fra DNA sekvenser Kvalitetssjekk av sekvenser svært viktig Kuratorer forlanger ofte rådataen fra sekvenseringen før de godkjenner nye alleler

Typingsmetoder og standartisering Gelbaserte metoder mot molekylære metoder Databaser må bli bygget på Standardiserte protokoller Strenge kuratorer Ringtester F.eks. PulseNet, MLST.net, spa-typing

eBurst Utviklet for MLST Analyserer hovedsakelig relasjonen mellom nært beslektede genotyper (klonale komplekser) Slektskap (distanse) mellom klonale komplekser blir ikke analysert Tar ikke hensyn til antall stammer i hver ST

Minimum spanning tree MST er et resultat av en graph som knytter alle hjørner sammen og gi dem en vekt.

Neighbor joining Det initiale treet er stjerneformet, nye noder blir tilføyet endene Forutsetter ikke en konstant evolusjonsrate Distans mellom to par må være kjent og er sentral Rask og ok for store dataset Avhengig av korrekt evolusjonsmodell

UPGMA Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean Gir dendrogram Forutsetter en konstant evolusjonsrate “Molekylær klokke” Enkleste metode for konstruksjon av et tre

Konklusjon Analyse må ta hensyn til: Epidemiologisk spørsmålstilling Typingsmetode Interpretasjonsmetode Tilgjenglige epidemiologiske data må trekkes inn i tolkningen