Oversikt over oppgaven Forsøk 1 ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 Real-time PCR Test av celletype- spesifikk mRNA c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs

Ulike mønstre av mRNA uttrykk Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener) Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA mRNA cDNA cDNA Kvantitering Referanse Ukjent

The quantitative assay - step by step Primer design RNA isolation cDNA synthesis Set up of the experiment Programming and running the LightCycler Optimizing the PCR reaction Interpretation of the results Troubleshooting 1 2 3 4 5 6 7 8

Stage 1: Primer design Length: 18-24 bp 1 GC content: 2 Sequence: 3 4 Try to make the two primers equal in length GC content: Between 40% and 60% with equal GC content in both primers Avoid an unbalanced distribution of G/C and A/T-rich domains Sequence: 3´-region most important, free of secondary structures, repetive sequences, palindromes, and highly degenerate sequences Last 5 nucleotides should contain no more than 2 G/C Melting temperatures Tm = temp at which 50% of the primer-target hybrids are single stranded. Depends on primer sequence and buffer composition Tm between 55-65oC, primers used together should have similar Tm value 1 2 3 4 5 6 7 8

2. step: RNA isolation Several methods Kits for cultured cells 1 2 3 4 GTC metoden Trizol metoden Ulike kommersielle kit Kits for cultured cells 5 x 106 cells/prep, expected yield: 10-20 ug/ 106 cells 1 2 3 4 5 6 7 8

Arbeid med RNA er krevende pga RNA lett degraderes RNA er et labilt molekyl som lett degraderes Pga 2´-OH som deltar i degraderings-mekanismen Pga RNAser som finnes overalt (fingre etc) og som er svært robuste enzymer (noen tåler koking). RNA er derfor langt mer ustabilt enn DNA I cellene er mRNA beskyttet dels med ende-modifikasjoner, dels via assosiasjon med protein Arbeid med RNA krever derfor særlig forsiktighet 1 2 3 4 5 6 cap AAAAAAAAAAAAA Pre-mRNA (hnRNA) mRNA 7 8

Tiltak for å unngå RNA degradering Unngå RNaser (allestedsnærværende) Bruk hansker (men ha ikke blind tiltro til hvor effektive de er) Løsninger behandles med DEPC (diethylpyrocarbonate) Bruk RNase-frie rør og pipettespisser (helst med filter) Elektroforesekar behandles med H2O2 Glass og metall varmebehandles: 180 oC minst 8 timer Bruk RNase inhibitorer DEPC (diethylpyrocarbonate) er et reaktivt alkyleringsagens Vanadyl ribonucleoside komplekser - ikke-kovalent inhibitors, må fjernes før RNA skal brukes videre pga inhibering av polymeraser Protein inhibitorer - et ca 50 kDa cytoplasmatisk inhibitor protein isolert fra placenta binder sterkt til og inhiberer mange Rnaser (kommersielle navn: RNasin, prime inhibitor etc) 1 2 3 4 5 6 7 8

Inhibitorer av Rnaser - DEPC DEPC (diethylpyrocarbonate) DEPC er et reaktivt alkyleringsagens som inaktiverer RNaser i buffere og på glassutstyr. Modifiserer Histidine grupper med ethoxyformyl DEPC reagerer med RNA og protein generelt, og kan derfor ikke brukes under isolering. Inaktiveres raskt i vann (halveringstid ca 10 min ved pH 7) og omdannes til CO2 og etanol. Bør ikke brukes sammen med Tris. Bruk: 0.1% DEPC i vann overnatt ved rom temp (eller 1 time 37oC) etterfulgt av vask med DEPC-behandlet vann og autoklavering 1 C-CH2-CH3 O 2 3 4 5 6 7 8

Hvordan isolerer vi RNA? Kit for RNA isolering The Absolutely RNATM RT-PCR miniprep kit Prinsipp Celler lyseres i nærvær av guanidin thiocyanat, en av de sterkeste kjente protein denaturanter, som inaktiverer Rnaser Pre-filter spin fjerner partikler og noe DNA RNA blir absorbert til en silika-basert fiber-matriks i nærvær av høye konsentrasjoner chaotropiske salter (mens kontaminanter vaskes ut).

Hvordan isolerer vi RNA? Prinsipp forts. Vask med lav-salt buffer Rester av DNA fjernes med DNase behandling Videre vask fjerner protein og rester av DNase Høy-renset RNA isoleres i et lite volum ved eluering med en buffer med lav ionestyrke og samles opp i mikrosentrifuge-røret Renset RNA Har lavere DNA-innhold enn mange metoder Er derfor velegnet for RT-PCR og real-time PCR analyser

3. step: cDNA synthesis Omdanning av mRNA til cDNA 1 oligo dT 2 5´ 3´ mRNA AAAAAAAAAAAAA 3´ 5´ cap 3 mRNA RT: Reverse transcriptase 4 5 6 Ulike kommersielle RT-enzymer Omniscript RT-kit (Qiagen) Kit from Roche: Master RNA Cybergreen Superscript (Life Technol.) 7 mRNA 8 Templat for Real-time PCR cDNA

Reaction mix for the LightCycler Template DNA cDNA from 50 ng total RNA, diluted 1:10 or 1:50 Primers 0.3-1.0 uM of each primer MgCl2 1-5 mM Nucleotides, Taq PCR buffer, Taq DNA Polymerase Included in the LightCycler DNA Master SYBR Green I 1 2 3 4 5 6 7 8

Samples to run 1 A series of dilutions are made to construct a standard curve for target gene Using a subclone of the target Sample (cDNA) with primers for target gene In the form of cDNA made from the isolated RNA Sample (cDNA) with primers for housekeeping genes for normalization purposes 2 3 4 5 6 7 8

Standard curve Use at least 3 concentrations for a standard curve Use serial dilutions that are one order of magnitude apart _ 1:10, 1:100, 1:1000,... For medium and high concentrations, a single point per concentration is sufficient 1 2 3 4 5 6 7 8

Programming the Lightcycler 1 2 3 4 5 6 7 8

Programming the Lightcycler Preincubation Denaturation Amplification Denaturation, annealing (primer dependent), elongation (bp/25 sec), cycle number (may be increased during run) Melting curve Primer dependent, 5-10 higher than the primer annealing temp Cooling Edit samples 1 2 3 4 5 6 7 8

Optimization - an important step 1 Finding optimal MgCl2 Find conc (1-5 mM) that gives best crossing point, signal intensity and slope Annealing temperature? Try to design primers with similar Tm, allows standard conditions of annealing temp Controls - positive and negative Always include a NTC (non template control, here water) to see primer-dimers Also include a positive control to see that the reaction works 2 3 4 5 6 7 8

Optimizing PCR conditions Template dilution Use dilution that gives crossing points in the 20-30 range Programming Annealing temp, elongation time Improve your primer design? If difficult to optimize, order new primers (much cheaper than long optimalization experiments) 1 2 3 4 5 6 7 8

Interpretation of the results Quantification by one or several standard curves Ratio: target gene/housekeeping gene in each sample Assumption: housekeeping gene expression = constant in the samples Normalisation of the total cDNA using constitutively expressed housekeeping genes 1 2 3 4 5 6 7 8 Jurkat/Myb = 2.351 Jurkat/PP1 HeLa/Myb = 0.107 HeLa/PP1

Interpretations of the results 1 Evaluation Parameters Error < 1 r = -1.00 Slope Melting curve analysis Primer dimers Expected melting point Calculations 2 E = 10 -1/slope E = 10 -1/-3.407 = 1.97 3 4 5 6 7 8 Jurkat/Myb = 2.351 Jurkat/PP1 HeLa/Myb = 0.107 HeLa/PP1 22 fold

Troubleshooting: Problem 1: primer dimers Primer-dimers interferes with quantitation LC with SYBR-green measures all DNA produced Primer-dimer is a template-independent product that also produces fluorescence Identifying primer-dimers: melting curve analysis Pure, homogenous PCR products produce a single, sharply defined melting curve with a narrow peak. Primer dimers melt at relatively low temperatures and have broader peak 2 3 4 5 6 7 8

How to avoid primer/dimers? General approaches Reduce delays in workflow Optimize primers - may be more important with LC than in conventional PCR Increase the annealing temperature Reduce annealing time to 1-5 sec. Use hot start inactive modified enzyme/Ab-bound enzyme that becomes activated after heat exposure LC-specific approaches Increase the temperature for fluorescence registration Use of hybridization probes rather than SYBR-green Reduce number of cycles, e.g. to 40. 1 2 3 4 5 6 7 8

Problem 2: RNA contaminated with genomic DNA Identify by running ± reverse transcriptase, compare Cps Traces of genomic DNA will work as templates interfering with quantitation, may reduce reproducibility 1 2 3 4 5 6 7 8

How to avoid problems with genomic DNA? Always include a DNase I purification step in the RNA isolation procedure Included in the kit used here Always run a ±reverse transcriptase reaction to check the quality of the RNA Used as the first experiment here 1 2 3 4 5 6 7 8

Mandag PP1 c-myb ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Forsøk 1 ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 Real-time PCR Test av celletype- spesifikk mRNA c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs

Tirsdag PP1 c-myb ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Forsøk 1 ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) Forsøk 2 Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) PP1 RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Forsøk 3 Tirsdag Real-time PCR Test av celletype- spesifikk mRNA c-myb Lightcycler Kvantitering av spesifikke mRNAs

Ulike mønstre av mRNA uttrykk Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener) Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA mRNA cDNA cDNA Kvantitering Referanse Ukjent

Criteria for single standard curve Equal Efficiency Required for Accurate Analysis Prerequisite: EfficiencyStandard = EfficiencyTarget Efficiency depends on: - fragment length - advantage with short PCR-products (100-200 bp) - intervening sequence - spacing RT primer to PCR primer - advantage to design primers in the 3´-part of the gene

Prerequisites of a suitable housekeeping gene RNA-specific detection pseudogene free amplification / detection specific for active target No regulation of expression level in the system analysed normal vs. tumor tissue unstimulated vs. stimulated cells Similar expression level compared to the target analysed

Housekeeping Genes ß-actin multigene family; > 20 genes; 1 active locus : hormones of tyroid gland 20 pseudogenes : stomach tumor g-actin multigene family; pseudogenes GAPDH multigene family; 10-30 genes; > 200 in mouse : lung, pancreatic, colon cancer mostly pseudogenes : insulin, EGF 5.8S,18S, 28S RNA pseudogenes ß2-microglobulin no pseudogenes : Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors G6PDH no pseudogenes : kidney, stomach tumor : hormones, oxidant stress, growth factors PBGD no pseudogenes aldolase pseudogenes HPRT pseudogenes U3, U8, ... Pseudogenes ornithin : tumors decarboxylase ... Gene Genomic structure / pseudogenes Regulation e.g. Author: T. Emrich GAPDH = Glycerinaldehyde-3-phoshate dehydrogenase G6PDH = Glucose-6-phoshate dehydrogenase PBGD = Phorphobilinogen deaminase HPRT = Hypoxanthine phoshoribosyltransferase