Oksidativ fosforylering

Presentasjon om: "Oksidativ fosforylering"— Utskrift av presentasjonen:

1 Oksidativ fosforylering
ATP syntese Winnie Eskild. IMBV 2004

2 Oksidativ fosforylering er siste trinn i nedbrytning av energigivende forbindelser
Elektroner fra Glykolyse Beta-oksidasjon Sitronsyre syklus Elektronene bæres av NADH eller FADH2 Elektronene avslutter sin vandring gjennom elektrontransportkjeden med å redusere oksygen

3 Oksidativ fosforylering
Oksidativ fosforylering finner sted i mitokondriene De involverte proteiner er integrerte i indre mitokondriemembran eller tett assosiert til den Her reduseres O2 til H2O og ATP dannes fra ADP og Pi

4 Oksidativ fosforylering
Oksidativ fosforylering kan deles i to deler: Transport av elektroner gjennom elektron transportkjeden og reduksjon av oksygen som binder protoner og blir til vann. Dette frigir energi som brukes til å pumpe protoner ut gjennom den indre membranen i mitokondriet. Tilbakeføring av protoner til matriks langs deres elektrokjemiske gradient og utnyttelse av den frigjorte energien til fosforylering av ADP til ATP.

5 Mitokondriet Mitokondriet er omgitt av to membraner
Ytre membran er fritt permeabel for små molekyler og ioner (< 5000 Da) via porin Indre membran har mye større areal enn ytre, foldet i ”kristae” To funksjonelle rom: indre(matriks) og ytre Indre membran er ikke permeabel for andre forbindelser enn de som har egne transportører Proteinene som utfører oksidativ fosforylering sitter i indre membran Elektrontransportkjeden ATP syntasen

6 Mitokondriematriks Her foregår SSS, fettsyre- og aminosyre nedbrytning, prosesser som frigir mange elektroner Disse elektronene bæres av kofaktorene: NAD+ (NADP+), FAD og FMN NAD+ kan bære to elektroner FAD og FMN kan bære en eller to elektroner Flavonukleotidene er sterkt bundet til de enzymer som de er kofaktorer for og som kalles flavoproteiner Noen flavoproteiner overfører sine elektroner direkte til elektrontransport kjeden, f.eks succinat dehydrogenase (SSS) De fleste av elektronene fra flavonukleotidene overføres til NAD+ NAD+/NADH kan fritt bevege seg omkring og levere elektronene sine til elektrontransport kjeden fra matrikssiden

7 Overføring av NADH til mitokondriematriks
Ikke alle NADH dannende prosesser finner sted i mitokondriematriks NADH fra glykolysen er dannet i cytosol og må overføres til matriks før det kan levere elektronene videre til elektrontransport kjeden Indre mitokondriemembran er ikke permeabel for NADH

8 Overføring av NADH til mitokondriematriks
To veier inn i elektrontransport kjeden: Elektronene fra NADH i cytosol overføres i molekylet malat via malat-aspartat shuttle. I matriks gjendannes NADH Glyserol-3-fosfat dehydrogenase

9 Malat-aspartat shuttle

10 Malat-aspartat shuttle
1) Enzymet malat dehydrogenase bruker NADH sine elektroner til å redusere oksaloacetat til malat 2) Malat transporteres gjennom membranen i bytte for a-ketoglutarat Transportøren er malat- a-ketoglutarat-transportøren, en antiporter

11 Malat-aspartat shuttle
3) I matriks reoksideres malat til oksalo-acetat av enzymet malat dehydro-genase (egne mitokondrie isoenzymer). Elektronene overføres til NAD+ som blir til NADH Denne NADH vil levere elektronene videre til elektrontransport kjeden Oksaloacetat må gjendannes i cytosol ellers stopper transporten opp 4)Oksaloacetat omdannes til aminosyren aspartat i en transamineringsreaksjon hvor glutamat leverer aminogruppen Enzymet her er aspartat aminotrans-ferase

12 Malat-aspartat shuttle
Herved omdannes glutamat selv til a-ketoglutarat 5) Aspartat overføres til cytosol via glutamat-aspartat transportøren i bytte for glutamat som hentes inn i mitokondriematriksen a-ketoglutarat overføres til cytosol via malat- a-ketoglutarat transportøren, en antiporter

13 Malat-aspartat shuttle
6) Aspartat, nå i cytosol, avgir aminogruppen til a-ketoglutarat Enzymet er aspartat amino-transferase Resultatet er gjendannelse av oksaloacetat og glutamat Netto resultat: overføring av to elektroner og en proton til mitokondriematriks, bundet til NADH og klar til videreførsel til elektrontransport kjeden

14 Glyserol-3-fosfat dehydrogenase (cyt)
Finnes spesielt i skjelett-muskel og hjerne Cytosol NADH donerer elektronene til reduksjonen av dihydroksyacetone-fosfat Enzymet er glyserol-3-fosfat dehydrogenase (cyt.) og det blir dannet glyserol-3-fosfat

15 Glyserol-3-fosfat dehydrogenase (mito)
Glyserol-3-fosfat reoksideres til dihydroksyacetonefosfat av enzymet glyserol-3-fosfat dehydrogenase (mito) som sitter i mitokondrie-membranen Dette enzymet overfører elektronene til FAD FADH2 gir elektronene videre til elektrontransport kjeden

16 Elektrontransport Fire typer elektrontransport
1) Direkte overføring: Fe 3+ + e- => Fe 2+ 2) H-atom overføring, dvs. H+ + e- : FAD +e- + H+ => FADH 3) Hydridion overføring, dvs. H+ + 2e- : NAD+ +2H+ + 2e- => NADH + H+ 4) Direkte overføring av e- til O2 : 4e- + O2 + 4H+ => 2 H2O Alle fire typer finnes i elektrontransportkjeden Begrepet reduserende ekvivalent brukes om én elektron som overføres

17 Elektrontransportkjedens elektronbærere
Ubiquinon Fettløselig benzoquinon med lang isoprenhale Diffunderer fritt i membranen Aktiv i membranassosierte elektronoverføringer Tar imot og gir fra seg en elektron og en proton om gangen Tar imot høyst to elektroner UQ + e- + H+ <=> UQH. + e- + H+ <=> UQH2

18 Elektrontransportkjedens elektronbærere
Cytokromene Stor gruppe, deles i a, b, c Har jern-porfyrin prostetisk gruppe A og b-gruppen har tett men ikke kovalent bundet jern-porfyringruppe C-gruppen har kovalent bundet jern-porfyringruppe Absorberer lys => er fargete (brune) Gis ofte navn etter bølgelengden med maksimal absorbsjon: cyt b562 Har jern-svovl senter som også deltar i elektronoverføring De fleste cytokromer er integrerte membranproteiner, viktig unntak er cytokrom c

19 Cytokromenes prostetiske grupper
Kovalent bundet til Cys

20 Cytokromene absorberer lys
Cytokrom c er vannløselig Assosierer ved hjelp av ladning med utsiden av mitokondrienes indre membran

21 Cytokromene har også Fe-S senter
Enkle jern-svovl proteiner: Uorganisk Fe er bundet direkte til Cys Komplekse jern-svovl proteiner: Uorganisk Fe og S bundet til Cys eller His Fe-S senteret overfører én elektron om gangen Reduksjonspotentialet modifiseres av proteinet: - 0, ,45V Disse proteinene absorberer lys i synlig område

22 Elektrontransportkjeden - oversikt
4H+ Bare kompleks I bidrar til protonoverføring Elektroner kommer inn fra 4 retninger og samles i ubiquinol: 1) NADH dehydrogenase (I) 2) Succinat dehydrogenase (II) 3) Glyserol-3-fosfat dehydrogenase 4) Elektronoverførende flavoprotein Kompleks II er succinat dehydrogenase fra sitronsyresyklus III = Ubiquinon-cytokrom c oksidoreduktase IV = Cytokrom oksidase

23 Elektrontransportkjeden
4H+ Elektroner kommer inn fra 4 retninger og samles i ubiquinol: 1) NADH dehydrogenase (I) 2) Succinat dehydrogenase (II) 3) Glyserol-3-fosfat dehydrogenase 4) Elektronoverførende flavoprotein Bare kompleks I bidrar til protonoverføring Kompleks II er succinat dehydrogenase fra sitronsyresyklus

24 Elektrontransportkjeden
Elektroner fra ubiquinol: III = Ubiquinon-cytokrom c oksidoreduktase IV = Cytokrom oksidase

25 Elektronenes vandringsretning
Elektronene vandrer mot høyere standard reduksjonspotentialene NADH-> Q -> cyt b -> cyt c1 -> cyt c -> cyt a -> cyt a3 -> O2 Hemmerne rotenon, antimycin A, CN- og CO blokkerer ETK på spesifikke punkter

26 Nettoreaksjon fra NADH/FADH2 til O2
NADH + H+ + 1/2 O H2O + NAD+ DG’o = kJ/mol, DG er nummerisk større i cellen FADH2 + 1/2 O H2O + FAD DG’o = kJ/mol Sterkt eksergone reaksjoner Energien brukes til å pumpe protoner ut av matriks Overføring av to elektroner fra NADH til O2 medfører utpumping av 10 protoner => dannelse av 2,5 ATP Overføring av to elektroner fra FADH2 til O2 medfører utpumping av 6 protoner => dannelse av 1,5 ATP

27 Kjemiosmotisk modell H+ ute = 10X H+ inne
Elektronenes vandring gjennom elektrontransportkjeden har medført: Frigjøring av energi ved overføring av elektroner til O2 Transport av protoner ut av matriks Ennå mangler syntesen av ATP

28 Kjemiosmotisk modell Ifølge denne modellen ligger den elektrokjemiske energien i proton-gradienten og ladningsforskjellen over mitokondriemembranen ATP syntesen drives av denne proton drivkraften Disse er koplete slik at ATP syntesen er avhengig av proton drivkraften og proton drivkraften (protongradient + ladningsforskjell) er avhengig av ATP syntesen

29 Kopling av elektronoverføring og ATP-syntese
Hemming av ATP syntese blokkerer elektronoverføring Har man isolerte mitokondrier og tilsetter succinat (elektron-donor) ses lite O2 forbruk Tilsettes ADP + Pi starter elektron-overføringen som avleses som O2 forbruk Nødvendigheten av ATP syntese ses ved stans i O2 forbruket når ATP syntase hemmes av venturicidin eller oligomycin Dinitrofenyl (DNP) kopler elektron-overføringen fra ATP syntese

30 Kopling av elektronoverføring og ATP-syntese
Blokkering av elektronoverføring hemmer ATP syntese Har man isolerte mitokondrier og tilsetter ADP og Pi ses lite O2 forbruk og lite ATP syntese Tilsettes succinat starter elektronoverføringen som avleses som O2 forbruk Nødvendigheten av elektron-overføring for ATP syntese ses ved stans i ATP syntese når CN- tilsettes Cyanid hemmer e- -overføring mellom III og IV

31 Kopling av elektronoverføring og ATP-syntese
Hvorfor stopper elektronoverføringen når ATP syntesen hemmes ? Hemmet ATP syntese betyr her at ATP syntasens protonkanal er lukket Protonutpumpningen fra mitokondriematriks kan fortsette en liten stund, men protongradienten blit steilere og steilere Til sist er forskjellen i protonkonsentrasjon mellom mitokondrienes indre og ytre rom for stor Den energi som frigjøres ved elektronoverføring er ikke lenger tilstrekkelig til å pumpe ut protoner mot en konsentrasjonsgradient

32 Kopling av elektronoverføring og ATP-syntese
DG er avhengig av DpH og DY som blir for store når ingen protoner får slippe inn i matriks igjen

33 Avkoplere En del kjemiske forbindelser er istand til å kople elektronoverføring fra ATP syntesen uten å ødelegge mitokondriemembranen Hydrofobe, svake syrer er udissosierte i cytosol. De passerer mitokondriets indre membran og dissosierer i matriks som er mere alkalisk enn cytosol Herved øker protonkonsentrasjonen i matriks og ødelegger protongradienten Elektronoverføringen fortsetter men det dannes ingen ATP Eksempler: dinitrofenyl (DNP) og FCCP (karbonylcyanid-p-trifluorometoksyfenylhydrazon

34 Avkoplere Ionoforer lager huller i membranen
Protonene trenger inn i matriks via disse huller og ikke via ATP syntasen Resultat: ingen ATP syntese

35 Kopling Kunstig lagde gradienter => ATP syntese
Mitokondrier ekvilibreres i buffer med pH 9 og 0,1 M KCl Det byttes til buffer pH 7 og uten KCl men med valino-mycin (K+-ionofor) tilsatt K+ slipper ut av matriks og det dannes en ladningsgradient Protongradienten er etablert ved hjelp av bufferen Mitokondriene lager ATP fra ADP og Pi uten å få tilført oksiderbare forbindelser

36 Oversikt - hemmere av ETK

37 ATP syntase Stort membranintegrert protein Består av to deler Fo og F1
Fo er en transmembran kanal hvor protoner passerer gjennom F1 er et perifert protein på membranens innside F1 utfører ATP syntesen

38 ATP syntese ATP syntese katalysert av ATP syntasen har DG’o = 0 kJ/mol, mens hydrolyse vanligvis har DG’o = - 30,5 kJ/mol Enzymet stabiliserer ATP mye mere enn ADP ved å binde det sterkere i det aktive setet Forskjell i bindingsaffinitet medfører frigivelse av mere bindingsenergi (ca 40 kJ/mol) ved binding av ATP enn ADP Dette er tilstrekkelig til å drive syntese av ATP fra ADP

39 ATP syntese Protondrivkreften brukes også til å overføre ADP og Pi til matriks samt til å eksportere ATP til cytosol Adeninnukleotid translokase er an antiporter som overfører ADP til matriks i bytte for en ATP som går til cytosol Ladningforskjellen mellom matriks (neg.) og cytosol hjelper denne utveksling Fosfat translokase, en symporter, over-fører en Pi sammen med en proton til matriks Denne ladningsneutrale overføring favoriseres av protongradienten

40 ATP syntese Protondrivkraften beskrives av uttrykket: DG = 2,3RT DpH + FDY DpH = 0,75 DY = 0,15-0,2 V (matriks er negativ) ATP syntese står ikke i et støkiometrisk forhold til protonutpumpingen Det er enighet om at 10/6 protoner pumpes ut for hvert elektronpar som overføres fra NADH/FADH2 til O2 Energien fra overføring av en proton brukes til å overføre en Pi til matriks Energien fra overføring av tre protoner brukes til fosforylering av ADP til ATP Utbyttet er dermed 2,5/1,5 ATP per elektronpar

41 Glucose kan gi 32 ATP pr molekyle

42 Brunt fettvev Inneholder proteinet termogenin
Termogenin danner en kanal i mito-kondriemembranen hvor protonene passerer gjennom Det lages ingen ATP Energien frigis som varme Nyfødte pattedyr og dyr som går i hi bruker denne mekanisme til å holde seg varme

43 Regulering av oksidativ fosforylering
ATP produksjonen reguleres hele tiden for å møte cellens behov Akseptor kontrol: respirasjonen reguleres av tilgangen på ADP Massevirkningdforholdet dvs forholdet ATP / ADP Pi regulerer Dette forholdet er normalt svært høyt dvs nesten alt er ATP Når cellens aktivitet medfører forbruk av ATP økes tilgangen på ADP og dermed øker respirasjonen Svært rask regulering sørger for nærmest konstante nivåer av ATP i enhver celle

44 ATP kontrollerer sin egen syntese
ATP/ADP ratioen kontrollerer alle viktige reguleringspunkter i katabolismen ATP kontrollerer dermed sin egen syntese