Mitokondriesykdommer i Norge Laurence Bindoff Universitet i Bergen

Oversikt Bakgrunn Klinikken Hvordan utreder man Hva finnes i Norge Hva gjør mitokondrie Hva jeg mener med mitokondriesykdom spesielle aspekter Klinikken Hvordan utreder man Hva finnes i Norge av pasienter og hjelp! Eksempler

Hva gjør mitokondriene? Energi produksjon OGSÅ Fett oksidasjon Uridin syntese Urea cycle enzymes + others

ATP ENERGI karbohydrat Fett, Protein Metabolisme NADH Flavoproteins Respirasjons - kjede Krebs ß-oxidation ATP ENERGI

Respirasjonskjeden 5 store komplekser Inner mito membrane OUT IN I II III IV V c Q 5 store komplekser Ligger i den indre mitokondrie membranen

Respirasjonskjeden I III IV II V Krebs β-oxidation Flavoproteins Proton motive force Q pool Q e- NADH Krebs β-oxidation NAD+ Flavoproteins FADH2 FAD+ ETF I H+ H+ H+ OUT c c e- Q c e- Inner mito membrane e- III IV Q e- II IN e- V O2+ 2H H2O ADP + Pi ATP H+

Mitokondrienes genetikk Nucleus Inner mito membrane OUT IN I II III IV V Q pool Q c Mitochondrial DNA 87 proteiner bare som inngår i respirasjonskjeden!

Mitokondrie DNA Sirkulær (16,5kb), Kodes for 13 RC proteins, 22 tRNA, 2 rRNA Arv maternal Polymorphisk høy mutasjons rate Multiple kopier 2 - 10 F V L I M Q W A N C Y S D K G R H E P T cyt b ND 6 ND 5 ND 4 ND 4L ND 3 COX 3 ATP ase 8 6 COX 2 COX1 ND 2 ND 1 12S rRNA 16S rRNA D-loop Light Strand Heavy Strand OL OH

Heteroplasmy & threshold Threshold (terskel) >90% 100 Normal Disease [Functionally recessive] 80 % mutant Degree of heteroplasmy Phenotype

Respirasjonskjeden I III IV II V IN Ubiquinone Cytochrome c OUT Q pool Mobile electron carrier Cytochrome c Mobile electron carrier Inner mito membrane OUT IN I II III IV V Q pool Q c Complex 3 11 subunits: 1 mtDNA encoded Complex 1 46 subunits: 7 mtDNA encoded Complex 4 13 subunits: 3 mtDNA encoded Complex 2 5 subunits; NO mtDNA encoded Complex 5 12 subunits: 2 mtDNA encoded

Kjernegen – svært viktige Assembly Transport Uptake mtDNA homeostasis Respiratory chain Inner mito membrane OUT IN I II III IV V Q pool Q c mtDNA

Eksempel 1 - Protein import

2 - mtDNA replikasjon mtDNA ADP ATP SSB POLG2 Twinkle dNTP’s POLG1 ANT1

3- sammensetting av cytochrome oxidase

Oppsummering Respirasjonskjeden frigjører energi fra matstoffene og gjør det tilgjengelig for kroppen Mitokondria innholder eget arvestoff Både struktur og funksjon avhenger av tett samarbeid mellom kjerne og mitokondrielle gener Dette betyr at det finnes mange muligheter å generere sykdom på

MEN, i tillegg Apoptosis Neurodegeneration Cancer Reactive oxygen species Cancer Ischaemia Drug metabolism Energy production

Mitokondriesykdommer

Det kliniske problemet -1 Mitokondriesykdommer Can affect any tissue all tissues have mitochondria Can present at any age from birth to >80 Demonstrate any pattern of inheritance autosomal, X-linked, maternal

Det kliniske problemet -2 Rammer vev med Høy energi behov Differensierte (ikke delings kapasitet) Muskel Øye Hjernen Pankreas Hjerte HVER og ALLE

Hvor stort er problemet Sverige (2001) Innsidens hos barn <16 = 1/11,000 Storbritannia (2005) nyeste tall 1:5000 Finland MELAS 1:3500 Australia (2003) prevalens 1:20,000 Her ble det undersøkt KUN kjente genetiske defekter derfor er dette et stort og økende problem

I Norge? Vanskelig å vite ennå Oversikt mest voksen pasienter (G71.3) 46 med sikker mitokondriesyk. sikker mito = histokjemisk mosaikk eller biokjemisk

Diagnose avhenger av: Klinisk oppmerksomhet Målrettet undersøkelser Må kunne gjenkjenner klassiske fenotyper Vær observant for de som kan være mitokondrielt visse kombinasjoner Målrettet undersøkelser

Appropriate investigation Clinical Recognisable phenotype Suspect phenotype blood Muscle biopsy Genetic analysis Genetic analysis Muscle biopsy Biochemical analysis Molecular diagnosis

- muskelbiopsi + Succinate Cytochrome dehydrogenase c oxidase I III IV Inner mito membrane OUT IN I II III IV V Q pool Q c + Succinate dehydrogenase Cytochrome c oxidase

mtDNA mutasjoner MELAS LHON Deletion > 100 mutasjoner MERRF A3243G CPEO/KSS F V L I M Q W A N C Y S D K G R H E P T cyt b ND 6 ND 5 ND 4 ND 4L ND 3 COX 3 COX 1 ND 2 ND 1 12S rRNA 16S rRNA D-loop LHON 3460 14484 11778 MELAS A3243G > 100 mutasjoner

Diagnostisering og Utredning Krever klinisk og laboratorisk kompetanse

Utredning – er enkel! Send pasient til meg! (ferdig med det?) Det holder ikke!! Ta opp anamnesen og undersøker pasienten – og så send pasienten til meg! Ikke det heller! Gjør absolutt hva dere vil med pasienten, MEN IKKE tar muskelbiopsien før du sender dem til meg

Eksempel Woman born ’63 Hyperglycaemia 2004 Sudden onset tinnitus Previously healthy, nurse Hyperglycaemia 2004 incidental finding, diet controlled Sudden onset tinnitus Mother - muscle cramps & deafness A brother DM + deafness Clinical neurological exam normal diabetes & deafness

Eksempel Man born ’68 December ’04 - Previously healthy April ’04 Found comatose and fitting unwell for 2 weeks Nausea, headache, reduced hearing Partial recovery December ’04 - ataxia, dysarthria; proximal weakness; areflexia, cognitive decline, cardiomyopathy

April 04 December 04

diagnosen - diagnosene?

3243A>G mtDNA mutation last cycle ”hot” PCR 3243A>G mutation in tRNAleu(UUR) mtDNA

No phenotype genotype correlation MELAS MELAS A3243G A3252G T3271C T3291C G1642A T9957C A3243G or CPEO Myoclonic Epilepsy or Diabetes/Deafness svær fenotypisk variasjon

Eksempel 24 yr old ♀ Exercise dyspnoea from age of 8. No COX negative fibres! 24 yr old ♀ Exercise dyspnoea from age of 8. Now - stops after one flight of stairs. Exercise can precipitates muscle pain lasting hrs – days Biopsy Combined SDH & COX Ragged brown fibres

A “new” ND5 mutation T13271 C Non RBF RBF Light Strand OH V L I M Q W A N C Y S D K G R H E P T cyt b ND 6 ND 5 ND 4 ND 4L ND 3 COX 3 ATP ase 8 6 COX 2 COX 1 ND 2 ND 1 12S rRNA 16S rRNA D-loop Light Strand OH A “new” ND5 mutation T13271 C L G P M Non RBF Non-RBF RBF 20 40 60 80 100 % level of13271T>C mutation RBF

Tissue distribution & family

Viser hva man må gjøre for å bekrefte en ny mtDNA mutasjon

Example 2 Man born 1942. From 30 y.o. poor night vision. Retinitis Pigmentosa. Blind 53 yr. Epilepsy started 52 y.o. Noted to have depressed reflexes Sensory loss right hand MRI normal. EEG: epileptic changes. Gait ataxia & Intractable epilepsy from 60 MRI - Atrophy, small ischaemic lesions. Stroke 61yo. Noted to have proximal weakness Cognitive decline Øyejournal er tapt. EEG: Konklusjon - Klart patologisk EEG. - Cerebrale funksjonsforstyrrelser med forholdsvis livlige epileptogene egenskaper. - Den epileptiforme aktivitet er særlig fremtredende frontotemporalt, tidvis med klar venstresidig overvekt.

Family + 9 (18) Mor hadde diabetes, demens og hørselstap Epilepsi. Diabetes. †87 . Demens. Diabetes. Hørselstap. Hørselstap Epileptisk anfall (20) Nevrogent hørselstap Trigeminus- nevralgi NIDDiabetes. Hypertension. CHD Occipital infarct.Epilepsy. Diabetes II † 51 (av ?) Epilepsi. Hypertensjon †6 mnd (av meningitt) Mor hadde diabetes, demens og hørselstap Tante hadde epilepsi og diabetes 2 søsken med diabetes type II, 3 med epilepsi, 2 med hørselstap. Neste slektsledd også epilepsi, diabetes, hørselstap og hjerneslag i ung alder. Alcoholisk pancreatitt. Diabetes II. Hjerneslag (36) Hørselstap? Bakre hjerneinfarkt (27) Barne-epilepsi

Muscle biopsy COX/SDH staining shows a mosaic COX positive & negative Diagnosis mitochondrial (probably mtDNA) Enkelte små atrofiske muskelfibre. Enkelte fibre med subsarkolemmalt basofilt kornet materiale. 50 % Type 1 og 2 ved ATPase farging pH9,4 Enkelte atrofiske type 2bfibre ved pH4,6. NADH-farging ankelte sterkt fargede type 1 fibre. Gomori: enkelte RRF. Cox/SDH – 20% blå fibre. ”Raggete blå”. Konklusjon: klare holdepunkter for mitokondriesykdom.

Genetic investigation Screened for MELAS mutation Whole mtDNA sequenced Several changes found including 5556G>C Gene for tRNA(trp)

Conserved? http://mamit-trna.u-strasbg.fr/table/Tryptophane.html

Segregates with affected tissue? mtDNA sequence from muscle Mutant C C C T C A C T A A G mtDNA sequence from blood Normal C C C T C A G T A A G 5556G>C mutation

Heteroplasmy? Muscle Blood Control Standard Vi bruker et restriksjonsenzym som kutter normale og muterte fragmenter forskjellig, slik at det dannes 2 eller 3 fragmenter. Her vist med ulike vev. Samme prinsipp for segregasjon i familien. Ikke så sensitivt med visuell avlesning som her. Blod fra pasienten ser ut som frisk kontroll, pga lav mutasjonsforekomst i blod. Dette er i samsvar med klinikken. For høyere sensitivitet og for å kunne kvantifisere mutert i forhold til normalt DNA brukes radioaktiv teknikk.

Family + 9 (18) Epilepsi. Diabetes. †87 . Demens. Diabetes. Hørselstap. Hørselstap Epileptisk anfall (20) Nevrogent hørselstap Trigeminus- nevralgi NIDDiabetes. Hypertension. CHD Occipital infarct.Epilepsy. Diabetes II † 51 (av ?) Epilepsi. Hypertensjon †6 mnd (av meningitt) Alcoholisk pancreatitt. Diabetes II. Hjerneslag (36) Hørselstap? Bakre hjerneinfarkt (27) Barne-epilepsi

Viser at alt som er sykdom blir ikke mitokondrielt betinget

mtDNA replication SSB POLG2 mtDNA Twinkle dNTP’s POLG1 ADP ATP ANT1

mtDNA polymerase gamma = Mitochondrial DNA dependant DNA polymerase Responsible for mtDNA replication & repair

POLG Clinical syndrome Starts with headache +/- epilepsy may be the same thing! headaches – migraine-like majority have occipital focus initially (visual phenomena) or ataxia central and sensory (true spinocerebellar) progressive develops in all (epilepsy almost all) or both

other features Myoclonus Cognitive impairment Depression Tremor Ophthalmoplegia (often a late feature)

Liver involvement Occurs with both mutations Liver failure common in terminal phase (multiorgan) elevated enzymes Liver failure precipitated in all but one case by sodium valproate? PM findings show centrolobular necrosis similar to Alpers

MRI – findings (1) Cerebellar atrophy

MRI – findings (2) 17 y.o. female with seizures + visual phenomena & simple motor seizures involving left arm/neck Admission 6 weeks later

Palatal myoclonus Inferior olivary nucleus

other investigations Muscle biopsy Neurophysiology CSF COX negative fibres - absent early multiple mtDNA deletions BUT may be detectable only by Rt-PCR Neurophysiology axonal > demyelinating neuropathy CSF raised protein

Clinical syndromes associated with POLG mutation adPEO arPEO (male sterility) more complex phenotypes PEO + Parkinsonism Alpers’ syndrome Ataxic syndromes

Patients 33 patients (32Norwegian + 1 Italian) belonging to 27 families. 2 POLG mutations most frequent: G1399A (giving A467T protein change). G2243C (giving W748S protein change). 3 distinct genotypes: homozygous G1399A. homozygous G2243C. compound heterozygous G1399A/G2243C.

Common in Norway! 200 Controls 2 heteroz A467T 2 heteroz W748S 100 blood donors 100 disease controls 2 heteroz A467T 2 heteroz W748S Carrier frequency = 1:50

The end