Modellering av metabolisme i Nannochloropsis gaditana

Presentasjon om: "Modellering av metabolisme i Nannochloropsis gaditana"— Utskrift av presentasjonen:

1 Modellering av metabolisme i Nannochloropsis gaditana
Eksamen i BT8118 Gunvor Røkke

2 Nannochloropsis Heterokont microalge
Sannsynligvis oppstått ved sekundær endosymbiose Diameter: ~ 3 µm Doblingstid: ~ 23 – 24 t Haploid genom

3 Hvorfor modellere metabolisme i Nannochloropsis?
Har relativt høy produksjon og lagring av fettsyrer Kan under visse forhold innehold 55 % fettsyrer i forhold til egen vekt [1] Produserer flere kommersielt interessante pigmenter Violaxanthin (370 € for 1 mg) [2] Zeaxanthin (245 € for 1 mg) [2] [1] Roessler et al. (1994) Genetic engineering approaches for enhanced production of biodiesel fuel from microalgae. ACS symposium, 1994 [2] Roy et al. (eds) (2011) Phytoplankton pigments. Cambridge University Press, New York.

4 Optimering Tradisjonelt sett:
Utsette alger for ytre stressfaktorer Nitrogenlimitasjon Temperaturøkning Økning av lysstyrke Genetisk manipulering Slå ut gener for å øke fluks gjennom andre reaksjoner Enklere å gjøre genetisk manipulering når man har en metabolsk modell tilgjengelig

5 Bygging av metabolsk modell for N. gaditana
Tilgjengelig informasjon om N. gaditana: Genom for stamme B-31 (sekvensert og annotert av Corteggiani Carpinelli et al, univ. Padova) Genom Kjerne: 21 kromosom (0,06 Mb – 1,55 Mb) Mitokondrie (0,04 Mb) Kloroplast (0,11 Mb)

6 Bygging av metabolsk modell for N. gaditana
Bygging av midlertidig modell Lagde MATLAB-skript som: Gikk gjennom alle kromosomer Plukket ut GI-nummer, navn og aminosyresekvens fra alle kodende sekvenser Opprettet fasta-fil med proteinsekvenser Fastafil ble brukt til å opprette modell i PlantSEED

7 PlantSEED Utviklet av Seaver et al. i 2014
Verktøy for å lette og standardisere prosessen med å bygge metabolske modeller av sekvenserte genom Inneholder database av referansegenom Inneholder informasjon fra AraCyc, KEGG, MetaCyc, PMN og MaizeCyc Setter opp modell ved å identifisere tilstedeværende gener med en metabolsk funksjon Gjør gapfilling

8 Output fra PlantSEED

9 Output fra PlantSEED

10 Output fra PlantSEED

11 Output fra PlantSEED

12 Output fra PlantSEED

13 Videre arbeid Verifisering av modell vha. MATLAB og cobra toolbox
Masse- og ladningsbalanse (CheckMassChargeBalance) Punkt 1: Eksportere modell fra KBase og laste den inn i MATLAB. Problem: Har ikke nok info i modellen til å sjekke masse- og ladningsbalanse Modeller kjører ikke når den lastes inn i MATLAB. Punkt 2: Få modellen til å kjøre i MATLAB Hente inn informasjon om metabolitter Problem med ladningsbalanse. En del av metabolittene har ifølge modellen ladning , og modellen inneholder kun ladde formler. Mangler en uladet formel for å regne ut riktig ladning.

14 Informasjon om metabolitter
Ville hente fra KEGG, siden metabolitt-id-er tilsynelatende er KEGG-id-er Metabolitt-id: cpdXXXXX KEGG-id: CXXXXX Ved nærmere ettersyn: Metabolitt-id ≠ KEGG-id Løsning: Skrive skript som finner riktige KEGG-id-er.

15 Skript for å hente KEGG-id-er

16 Skript for å hente metabolittinfo fra BioCyc
Kjemisk formel SMILES Navn / synonymer Gibbs frie energi ChEBI-id ChemSpider-id KEGG-id PubChem-id

17 Resultater fra skript Begge skript hentet riktig informasjon i ~ 60 % av tilfellene Problem med søkefunksjon på både KEGG og BioCyc: Lister ofte ikke opp den eksakte metabolitten først Eks: Glukose Løsning: KEGG API!

18 KEGG API

19 Skript for å hente informasjon fra KEGG API
Bytter ut tegn i søkeord med HTML- varianter for tegn Henter nettside med urlread Setter inn resultater fra treff i tabell, der rader er forskjellige metabolitter, og kolonner er synonymer for samme metabolitt Går gjennom celler i tabell og søke på eksakt navn på metabolitt Hvis treff; henter ut KEGG-id Hvis ikke treff; henter ut KEGG-id for det nærmeste treffet

20 KEGG-id-er Fant KEGG-id for 775 av 903 metabolitter
128 metabolitter mangler i KEGG Skrev nytt skript som går inn i KEGG og henter formler Brukt formler til å finne ladning, og legge inn denne i modell.

21 Biomasse Lastet første gang inn via sbml-format
Mistenker feil under eksport eller import av sbml-fil Anbefalt versjon i Thiele & Palsson, 2010 er å laste inn via xls-format Kopierer reaksjoner fra KBase manuelt, og setter inn i excel-fil Konvertering til xml vha. Perl-skript Modell kjørte fremdeles ikke

22 Biomasse Vil finne ut om reaksjoner som produserer komponenter som inngår i biomasse går Pyridoxal phosphate Phytosphingosine Folinic acid L-Alanine NADPH Oxaloacetate Xylose alpha-L-Arabinose L-Lysine alpha-D-Mannose ,10-Methylenetetrahydrofolate alpha-D-Galactose ATP L-Leucine dATP Choline L-Cysteine Glycine Ethanolamine dCTP Thiamin diphosphate Plastoquinone beta-D-Fructose Hexadecanoic acid Tetrahydrofolate L-Phenylalanine NAD dGTP Zeatin NADH alpha-L-Rhamnose + 30 H2O Indole-3-acetate Ethylene L-Histidine cis-Aconitate dTTP Ferulate L-Proline L-Tyrosine alpha-Tocopherol beta-Sitosterol UDP-6-sulfoquinovose Coumarate UTP L-Glutamate myo-Inositol L-Aspartate Campesterol beta-Carotene L-Tryptophan Cl (S)-Malate L-Isoleucine Potassium cation sn-Glycerol 3-phosphate L-Serine CoA ,10-Methenyltetrahydrofolate L-Arginine Lutein S-Adenosyl-L-methionine Formyltetrahydrofolate CTP GTP Octadecanoic acid Chlorophyll a Stigmasterol alpha-D-Glucose Ascorbate Heme O (R)-Lipoic acid L-Asparagine D-Galacturonate beta-D-Glucopyranuronic acid Pantetheine 4'-phosphate Biotin Methyltetrahydrofolate FAD L-Glutamine NADP beta-D-Ribofuranose L-Valine L-Threonine (S)-Lactate L-Methionine FMN Citrate -> 30 H Diphosphate + 30 Orthophosphate + 30 ADP + 1 Biomass 88 metabolitter inngår i biomassereaksjonen

23 Biomasse Kjører script som går gjennom alle dannelsesreaksjoner i S-matrise for komponenter som inngår i biomasse, og søker i fluksvektor for å finne ut om reaksjoner går Svært få reaksjoner kjører. Gjelder også utvekslingsreaksjoner 286 dead end-metabolitter Studerer utvekslingsreaksjoner generelt

24 Utvekslingsreaksjoner
Feil i utvekslingsreaksjoner Alle har kun én negativ koeffisient i S-matrise Foreløpig form: cpd00001[e0] -> Gjør om til cpd00001[e0] -> cpd00001[c0] Modell kjører fremdeles ikke, men når jeg vet at dette er et problem, kan dette blokkere flere reaksjoner enn bare utvekslingsreaksjonene.

25 Utvekslingsreaksjoner mellom organeller?
>> deadEndCompartmentFinder Cytosol dead ends: 145 out of 568 metabolites Plastid dead ends: 51 out of 146 metabolites Extracellular dead ends: 0 out of 17 metabolites Golgi dead ends: 6 out of 6 metabolites Mitochondria dead ends: 29 out of 79 metabolites Nucleus dead ends: 5 out of 5 metabolites Endoplasmatic reticulum dead ends: 15 out of 31 metabolites Vacuole dead ends: 11 out of 13 metabolites Cell wall dead ends: 5 out of 5 metabolites Peroxisome dead ends: 19 out of 33 metabolites

26 Xanthofyller Legger merke til at modell inneholder få xanthofyller
Xanthofyllsyklus mangler Legger til reaksjoner i xanthofyllsyklus i plastid model = addReaction(model, ‘R07178’, {‘cpd08614_d0’, ‘cpd00072_d0’, ‘cpd08579_d0’, ‘cpd05422_d0’, ‘cpd00001_d0’}, [ ], false, 0, 1000)
 model = addReaction(model, ‘R07179’, {‘cpd08579_d0’, ‘cpd00072_d0’, ‘cpd06098_d0’, ‘cpd05422_d0’, ‘cpd00001_d0’}, [ ], false, 0, 1000) model = addReaction(model, ‘R07199’, {‘cpd06098_d0’, ‘cpd00005_d0’, ‘cpd00067_d0’, ‘cpd00007_d0’, ‘cpd08579_d0’, ‘cpd00006_d0’, ‘cpd00001_d0’}, [ ], false, 0, 1000) model = addReaction(model, ‘R07200’, {‘cpd08579_d0’, ‘cpd00005_d0’, ‘cpd00067_d0’, ‘cpd00007_d0’, ‘cpd08614_d0’, ‘cpd00006_d0’, ‘cpd00001_d0’}, [ ], false, 0, 1000)

27 Videre arbeid Få modellen til å gå!!
Finne ut om biomassereaksjon i modell stemmer med biomassekomposisjon i virkeligheten Legge til produksjon av flere xanthofyller

28