API seminar 11 mai 2005 Marietta Skaar Oversikt Historikk Numerisk Identifikasjon Praktisk Identifikasjon Metodikk, standardisering og feilkilder Prinsipp.

Presentasjon om: "API seminar 11 mai 2005 Marietta Skaar Oversikt Historikk Numerisk Identifikasjon Praktisk Identifikasjon Metodikk, standardisering og feilkilder Prinsipp."— Utskrift av presentasjonen:

1

2 API seminar 11 mai 2005 Marietta Skaar

3 Oversikt Historikk Numerisk Identifikasjon Praktisk Identifikasjon Metodikk, standardisering og feilkilder Prinsipp for API Tokning av resultater

4 Tilstede i 130 land –33 datterselskaper –115 distributører 2001: Omsetning på 800mill Euro 12% av omsetningen brukes til forskning og utvikling Noen fakta…

5 Utviklet i 1968-69 Ide: Standardisere og miniatyrisere tradisjonelle bakteriologiske tester Databasen basert på en stammebank med over 25 000 stammer Brukes i over 120 land,1500 publikasjoner 600 publikasjoner på API 20 E alene Referansemetode i USA, Japan, Australia og Europa Noen fakta…

6 5 Klassifisering

7 6 Gram negative staver Reading after 24hrs of incubation Gram (-) Staver Lactose -Lactose + Oxidase + API 20 N E Oxidase - API 20 E

8 7 Gram (+) staver Gram + Staver Katalase - Katalase + Small characteristic bacilli slight discoloration (granulations) Short cocco- bacilli Elongated shape bacilli Small opaque colony Motility at 20-25°C non motile at 37°C API LISTERIA API 50 CHL API CORYNE Large bacilli with spores API 50 CHB

9 8 Gram (+) kokker Gram + Kokker fri Koagulase API STAPH katalase - katalase + Staphylococci Koagulase (-) Staphylococcus aureus hemolyse API 20 STREP

10 9 Numerisk Identifikasjon

11 10 Definisjon Deteksjon av et ukjent element ved å definere hvor den hører til i en av de predefinerte klassifiserings grupper familie genus species Identifikasjon

12 11 Bakteriell identifikasjon er vanskelig u Taxonomien er kompleks og under stadig utvikling u Antall tilgjengelige biokjemiske tester er høyt u Bakterier er levende organismer som endres u Databehandling og tolking er vanskelig Identifikasjon

13 12 Målrettet identifikasjon Prinsipp u Svar på et lukket spørsmål ”Er dette denne bakterien, ja eller nei ?" u Krever pre-selektering av species : ä Regelmessig ä Alvorlig (Salmonella, Listeria, Staph aureus,...) u Krever bruk av en enkel og rask teknikk u Krever en nøyaktig teknikk Identifikasjon

14 13 Målrettet Identifikasjon Teknikker u Agglutinasjons tester u Nukleære prober u Immunoassay u Kromogene dyrkningsmedier Identifikasjon

15 14 Komplett Identifikasjon Prinsipp u Svar på et åpent spørsmål? ”Hvilken bakterie er dette ?" u Stort antall tester brukes u Nøyaktig og definitiv ID oppnås Identifikasjons systemer u Manuelle metoder API strips u Semi automatiske metoder ID 32 strips u Automatiske metoder Vitek Identifikasjon

16 15 Definisjon Kombinasjon av : u En hel gruppe av biokjemiske tester valgt på grunnlag for å optimalisere ID av en bestemt gruppe bakterier u Spesifikk database Resultatet tolkes ved å behandle alle testene under ett Identifikasjon

17 16 Gruppene etableres ved å bruke grunnleggende vanlige egenskaper u Godt definert taxonomi gir high-performance system u Dårlig definert gruppe kan maksimalt identifisere species (Eks : 60% av Corynebacteria er kjent) Identifikasjons system = Reflekterer taxonomien u Morfologi u Gram Farging u Krav til dyrking av kultur u Basale orienteringstester (katalase, oxidase,...) Identifikasjon

18 17 API og ID Strips Stripsene består av ulike tester Testene er : u Valgt ut fra bakteriell gruppe som skal undersøkes u Optimalisert for denne gruppen å Oppnå raske, pålitelige svar (Eks : enterobactericeae og Staphylococci ulike resultat for "Citrate" og "ADH" testene) bioMérieux Identifikasjon

19 18 Testene må adapteres for å tilpasses formatet u Alle resultatene ferdig samtidig u Ta hensyn til test miljøet på stripsen (produksjon av syredamp, CO2,...) Ta hensyn til mijø begrensninger : u Testene plasseres i et bestemt mønster på grunnlag av studier u Innhold og metode i hver test er spesifikt definert u Databasene er etablert basert på reelle resultater og reflekterer arbeidsoperasjonene bioMérieux Identifikasjon

20 19 Derfor : u Er det ofte ikke mulig å sammenlike testresultater fra et ID system med tester funnet i litteraturen u Det er det totale resultatet av et ID system som teller u Resultatet av en enkelt reaksjon har ingen betydning u Ved å ta hensyn til alle testene, er identifikasjon mulig, selv om en eller flere av dem er atypiske bioMérieux Identifikasjon

21 20 Databaser Prosentvise positive reaksjoner for hver test og for hvert species som kan identifiseres bioMérieux taxonomi = Offisiell taxonomi (International Journal of Systematic Bacteriology) u Species u Biotype u Genus u Gruppe av species Base enhet = Taxon bioMérieux Identifikasjon

22 21 Utvikling av databaser Databasen oppdateres regelmessig Avhengig av : u Utviklingen av taxonomien u Beskrivelse av nye species u Biokjemisk utvikling av nye species u Nye krav til Identifikasjon bioMérieux Identifikasjon

23 22 Utvikling av databaser u Nok tilgjengelige resultater for det gjeldende system u Referanse identifikasjon er korrekt u Species kan identifiseres ved hjelp av en strip test u Resultat utførelse av species allerede i databasen ikke endres Integrasjon av nye species mulig så lenge som: bioMérieux Identifikasjon

24 Identifisering av Mikroorganismer Variable faktorer Standardisering Feilkilder

25 Har dere sett dette før? Neg P Neg Pos Neg?Neg?Pos?

26 Variable Faktorer Stamme som undersøkes Tettheten på inokulatet Agar brukt for å dyrke bakterien Inkuberingsforhold –Temperatur –Fuktighet –Atmosfære Alder på kultur Påvirket av antibiotika?

27 Standardisering –Generell metode Primær agar eller spredningsagar Oppslemming til riktig tetthet Sekundærspredning for verifisering av renkultur eller for tilleggstester Oppsett, inokulering av valgt type strips. Mineralolje i gitte brønner

28 Inkubering Riktig inkuberingslengde Fuktig miljø Riktig temperatur Visuell eller automatisk avlesning Tolkning av svar APILAB/mini API

29 Feilkilder Det sies at API og ID ikke alltid gir reproduserbare svar HVORFOR? API er et miniatyr system med reproduserbare reaksjoner, men feil kan oppstå i alle ledd Fra før oppsett skjer til avlesning er ferdig

30 Valg av agar For selektiv agar Påvirker de biokjemiske reaksjonene Endrer vekstegenskapene hos stammen For lav næringsverdi i agaren Stressete bakterier vil ikke gi et optimalt biokjemisk mønster Hva kan gå galt? Valg av kolonier For gammel kultur Bakteriedød i kulturen gjør at man får en tetthet i inokulatet som bare tilsynelatende er riktig Kan gi falske negative reaksjoner Gul –rød – oransje brønner Uren kultur Mange positive tester, gir uriktig svar om svar i det hele tatt

31 Valg av suspensjonsmedium Galt medium kan føre til at bakterien ikke er i stand til å formere seg, eller at den vokser for langsomt Falske negative reaksjoner Gul –oransje -rød? Feil temperatur på mediet For kaldt medium kan føre til forsinket vekst, eller i verste fall ingen vekst Falske negative reaksjoner Gul –oransje-rød? Hva kan gå galt?

32 Valg av strips Orienteringstester Feil strips- ingen svar Fylling av brønner Over/ under fylling av brønner kan gi uforutsigbare reaksjoner Mineralolje Hva kan gå galt?

33 Inkubering For kort tid Falske negative reaksjoner Gul – oransje –rød? For lang tid Reversering av reaksjoner kan gi falske negative reaksjoner Fargeendring i fermenteringsreaksjoner kan gi falske positive svar Hva kan gå galt?

34 Temperatur For lav temperatur Falske negative reaksjoner Gul – oransje –rød? For høy temperatur Ingen vekst av organismen kan føre til falske negative reaksjoner Hva kan gå galt?

35 Fuktighet For lav fuktighet Uttørring av brønnene kan gi inkonklusive reaksjoner NB! De fleste inkubatorer i dag er for tørre! Hva kan gå galt?

36 Avlesning av strips -Reagenser -Uriktig oppbevaring gir falske negative reaksjoner -Avlesing av reaksjoner etter for kort eller for lang tid kan gi +/- reaksjoner -Gul –oransje – rød? -Ulike personer leser av ulikt og får dermed ulike svar Hva kan gå galt?

37 Tolkning av svar Hva kan gå galt?

38 Standardisering Bruk ferske kolonier og en næringsrik, ikke selektiv agar Bruk Densimat for å bestemme McFarland Inokulat: –Generelt brukes fysiologisk saltvann, enten egne glass eller API ampuller –Gjør sekundærutstryk fra inokulatet for å verifisere renkultur og for eventuelle tilleggstester –Hold mediet minimum ved romtemperatur

39 Reagenser: – Kan ikke brukes mer enn 30 dager –FB og ZYM B er temperatur og lysfølsom –NIN er lys og vannfølsom –PYZ er følsom for luft Pakk inn reagenser som er lysfølsomme i aluminiumfolie, og sett temperaturfølsomme reagenser tilbake i kjøleskapet så raskt som mulig! Standardisering

40 Etabler en rutine for å standardisere avlesning –Intern sjekk med jevne mellomrom for å sjekke at alle leser av reaksjonene hos en bestemt stamme identisk Bruk informasjonen fra APILAB systematisk til å vurdere sikkerheten i svaret Standardisering

41 Ikke resultat eller ikke forventet resultat? Sjekke strips på nytt: –Se om det er noen positive reaksjoner –Sjekk om det er svake reaksjoner? Tynt inokulat? –Hvis alle reaksjoner er negative: Riktig strip? Mikrobe død? –Tvilsomme reaksjoner: Grader positiviteten Sett ?

42 Gå eventuelt tilbake og sjekk: –Tilstrekkelig tykt inokulat –Renkultur på agar –Alder på spredning –Anbefalt agartype brukt –Primære tester: Gram positive/ Negative –Er riktig strip brukt ut fra primære reaksjoner Ikke resultat eller ikke forventet resultat?

43 Prinsipp for API

44 Alle API testene bygger på bruk av 5 prinsipper Fermentering: –Karbohydrat katabolisme med dannelse av syre. pH i mediet synker, og dette synliggjøres med en indikator

45 Assimilering: –Mikroorganismenes evne til å nyttiggjøre seg av en karbonkilde fra et spesifikt substrat for å vokse Karbohydrat Aminosyrer Organiske syrer Hemming av assimilering eller fermentering –Tilsetning av antibiotika eller kjemiske midler med potensiell toksisitet til en fermentasjon eller assimilerings- eller fermenteringstest Prinsipp for API

46 Enzymatisk reaksjon –Det syntetiske substratet som finnes dehydrert i brønnen detekterer spesifikk enzymatisk aktivitet hos bakteriestammen. Tilstedeværelsen av et slikt enzym synliggjøres ved spontan fargeendring eller etter tilsetning av et reagens Konvensjonelle tester –Tradisjonelle biokjemiske reaksjoner Prinsipp for API

47 Tolkning av resultater – % ID –T verdi –Tester i mot

48 –Hvor sannsynlig det er for at den aktuelle organismen virkelig er den som databasen foreslår –Et matematisk uttrykk for hvor tett din profil ligger opp til den foreslåtte, i forhold til alle profiler i databasen Eks. API 20 E har 10 000 profiler % ID

49 –Kan maksimalt være 99.9 % –bør være minst 80.0 % –Alternativt: Dersom det er flere klasser under first choise, så bør summen være minst 80.0 % AB C X % ID

50 –”Typicity indeks” –Et skjønn over hvor tett aktuell profil er opp mot den mest typiske profil –T indeks er omvendt proporsjonal med antall tester i mot –T indeks kan maksimalt være 1.00 –Verdier under 0.50 bør vurderes sterkt Profil x Typisk profil T indeks

51 Atypiske tester –Anføres med % for positive reaksjoner Tester i mot: –Positiv test når % positivitet er  25 % –Negativ test når % positivitet er  75 % Tester totalt i mot: –Positiv test når % positivitet er = 0 % –Negativ test når % positivitet er= 100 % Tester i mot/ Atypiske tester

52 Hvert resultat har en tilhørende kommentar –Valgt på bakgrunn av % ID og T- indeks –Uttrykker påliteligheten til svaret Vurdering av resultatet avhenger av kommentaren –Må vurderes før man vurderer de enkelte mulighetene –Aldri aksepter et svar som ikke har en kommentar bedre eller lik ”acceptable identification” uten tilleggstester Tolkning av svar

53 Kommentarer –Excellent Identification% ID > 99.9 og T= 0.75 –Very good identification % ID > 99 og T= 0.5 –Good Identification % ID > 90 og T= 0.25 –Acceptable Identification % ID > 80 og T= 0.25 Tolkning av svar

54 Resultater som ledsages av de nevnte kommentarer kan aksepteres Aldri aksepter et resultat med ”low discrimination” uten tilleggstester I tilfelle av ”doubtful profile”, sjekkes feilkilder Tolkning av svar

55 Noen eksempler….

56 Reference: Eksempel Date: 10/3/2003 EXELLENT IDENTIFICATION ____________________________________________ Strip: API 20 NE Profile : +-- +-- +-+ --+ +++ +++ +-+ NO3+ TRP- GLU- ADH+ URE- ECC – GEL+ PNPG- GLUa- ARAa- MNE- MANa+ MAGa+ MALa+ GNTa+ CAPa+ ADIa+MLTa+ CITa+ PACa- OX+ --------------------Significant taxa--------------------------%ID ----------T--------Tests against------------- Aeromonas hydrophila 99.9 1.00 ______________________________________________________________________________

57 Reference: Eksempel Date: 10/3/2003 VERY GOOD IDENTIFICATION ____________________________________________ Strip: API 20 E Profile : --- +?+ ++- --+ --- --- --- ONPG - ADH – LDC – ODC- CIT ? H2S + URE + TDA + IND – VP – GEL – GLU + MAN – INO – SOR – RHA – SAC – MEL – AMY – ARA – OX – --------------------Significant taxa--------------------------%ID ----------T--------Tests against------------- Proteus mirabilis 99.8 0.78 1 Next choise Morganella morganii 0.1 0.23 2 ______________________________________________________________________________ Proteus mirabilis:1 test(s) against GELATINE ( HYDROLYSE)(GEL) 82% ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Next choise Morganella morgani: 2 tests against H2S PRODUCTION( H2S) 1% INDOLE(IND) 99%

58 Reference: Eksempel Date: 10/3/2003 VERY GOOD IDENTIFICATION ____________________________________________ Strip: API 20 NE Profile : +-- +-- +-+ --+ +++ +++ +-+ NO3+ TRP- GLU- ADH+ URE- ECC – GEL+ PNPG- GLUa- ARAa- MNE- MANa+ MAGa+ MALa+ GNTa+ CAPa+ ADIa+MLTa+ CITa+ PACa- OX+ --------------------Significant taxa--------------------------%ID ----------T--------Tests against------------- Pseudomonas aeruginosa 99.9 0.67 1 ______________________________________________________________________________ Pseudomonas aeruginosa :1 test(s) against MALa (MALa) 1% ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Next choise

59 Reference: Eksempel Date: 10/3/2003 DOUBTFUL PROFILE ____________________________________________ Strip: API CORYNE Profile : +++ --- --- +-- --- --+ --- NIT+ PYZ + PYRA + PAL- ßGUR – ßGAL – ßGLU- ßNAG- ESC- URE+ GEL- 0- GLU- RIB- XYL – MAN – MAL –LAC+ SAC – GLYG – CAT - --------------------Significant taxa--------------------------%ID ----------T--------Tests against------------- Coryn.pseudodipht. 85.2 0.16 2 Erysl.rhusiophatiae 14.6 0.09 4 ______________________________________________________________________________ Coryn.pseudodipht :2 test(s) against (LAC) 0%(CAT) 100% ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- Next choise :4 test(s) against Erysl.rhusiophatiae (NIT) 1%(PYZ) 7% (ßNAG) 96%(URE) 14%

60 Takk for meg..