Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

Modell Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer –Forutsagt effekt.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "Modell Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer –Forutsagt effekt."— Utskrift av presentasjonen:

1 Modell Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer –Forutsagt effekt av GTP til ITP (svekket terminering) Flere andre forhold bidrar Kontekst, NTP, supercoil osv

2 Assistert terminering - rho-avhengig Noen termineringsseter krever en hjelpefaktor (rho-faktor) Rho = Hexamer NTPase som katalyserer opptvinning (unwinding) Modell –Rho binder RNA oppstrøms via et spesifikt motiv, migrerer mot polymerasen, opptvinning, frigjøring av transkript

3 Rho factor. Page 1231 The Rho protomer with its N-terminal domain cyan, its C- terminal domain red, and their connecting linker yellow.

4 Rho factor. Page 1231 The Rho hexamer. Its six subunits, each of which are drawn in a different color, form an open lock washer-shaped hexagonal ring.

5 Rho factor Page 1231 The solvent-accessible surface of the Rho hexamer as viewed from the top of Part b.

6 Hvordan regulere transkripsjon? Behov for regulering: –Nivå: Noen mRNA trenges i store mengder, andre i små –Timing: Forskjellige mRNA trenges til ulike tidspunkt –Respons: Noen mRNA trenges bare i visse miljø (nærvær av ulike næringsstoffer) Hvordan oppnås ulike transkripsjonsnivå?

7 Rask endring i prokaryoter Koblet translasjon /transkripsjon gir respons innen minutter –Translasjon av mRNA før transkripsjon er ferdig –mRNAs levetid også kort (1-3min)

8 Enkel regulering av NIVÅ via ulike optimale promotere lacI genet er lavt uttrykt pga svak promoter (avvik fra consensus) Svak Sterk <10 mlk pr celle mlk pr celle

9 Regulering av TIMING - serie av sigma-faktorer Utvikling/differensiering = tidsmessig ordnet ekspresjon av gen-programmer Fag-infeksjon - enkel modell for slik timing –Early - middle - late genes B.subtilis infisert av fagen SP01 –Early genes - via vertens RNAP/  - normale promotere –Et tidlig produkt =  gp28 en ny  med endret promoterpreferanse –Middle genes - via vertens RNAP/  gp28  - egne promotere –Late genes - via vertens RNAP/  gp33/34  - egne promotere

10 Regulering av RESPONS - via repressorer (og aktivatorer) Prokaryot transkripsjons-regulering via tre elementer: Promotere gjenkjennes av RNA polymerasen Operatorer gjenkjennes av repressorer Positive kontrollelementer gjenkjennes av aktivatorer

11 Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter Grunntilstand –Aktiviteten av en promoter in vivo i fravær av regulatoriske sekvenser og aktivatorer/repressorer Prokaryoter: grunntilstand = åpen –Ingen begrensning på RNA polymerasens tilgang til promotere –Repressorer blokkerer tilgang –Aktivatorer kun nødvendige på visse svake promotere Eukaryoter: grunntilstand = lukket ( pga kromatin ) –En sterk core-promoter alene er inaktiv i eukaryoter –De fleste eukaryote gener krever aktivatorer

12 Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter Prokaryoter Eukaryoter

13 Lac operon Eksempel på repressorregulering av promotertilgang

14 Induksjon- tilpasning til næring E.coli lager enzymer for laktosefermentering kun når laktose er til stede + lactose - rask induksjon av –galaktosid permease –ß-galaktosidase Inducer = 1,6-allolactose –Lab:IPTG

15 Genetisk kartlegging Operon Strukturelle gener –Proteinkodende Operator –Bindingssekvens for regulator Promoter –Bindingssekvens for RNA polymerase

16 Evidens for repressor Konstitutive mutasjoner – lac-operonet aktivt i fravær av inducer Mutasjon mappet til lacI genet –lacI ligger utenfor operonet lacI virker i trans via kodet protein-produkt (lac repressor) O c mutasjoner samme effekt men virker i cis (operator mutasjon)

17 Konjugasjon - evidens for at lacI virker i trans I+Z+I+Z+ I-Z-I-Z- Uten inducer ß-gal syntese starter pga Z + Represjon forsinket Pga lacI virker i trans

18 The nucleotide sequence of the E. coli lac promoter–operator region. Page 1239

19 Systemet Uten inducer: AV –Lac-repressor binder operator Med inducer: PÅ –Lac-repressor inaktiveres av inducer

20 Lac repressor Tetramer Hver monomer binder IPTG DNA gjenkjenning via sliding –Raskere enn diffusjon IPTG Kd = M Kd = M

21 Mekanisme for Lac represjon Lac operator og promoter overlapper - trolig at repressor blokkerer tilgang for RNA pol Likevel, noe mer

22 X-Ray structure of the lac repressor subunit. Page 1248

23 X-ray structure of the lac repressor- DNA complex. Page 1249

24 NMR structure of the lac repressor-DNA complex. Page 1249

25 Model of the 93-bp DNA loop formed when lac repressor binds to O 1 and O 3. Page 1250

26 Katabolittrepresjon Eksempel på aktivering av gener via CAP-cAMP komplekset

27 Glukoses forrang Glukose foretrukket metabolitt Katabolitt represjon –nærvær av glukose hindrer uttrykk av gener nødvendige for annen fermentering (laktose, arabinose, galaktose) Hvordan senses høy/lav glukose? via cAMP! –Glukose senker cAMP-nivået

28 Eksempel på katabolittrepresjon – lac-operonet Lac-operonet ”skrus på” av laktose Lac-operonet ”skrus av” av glukose Induksjon Katabolitt represjon

29 CAP eller CRP 90 o Respons overfor cAMP skjer via CAP –= Catabolite gene activator protein –Kalles også CRP (cAMP receptor protein) cAMP-bindende dimer Endrer konformasjon ved binding av cAMP

30 Mekanisme for aktivering? CAP kan kontakte RNA pol direkte –CAP binder oppstrøms initieringskompleks –De to bindes i løsning CAP endrer DNA-konformasjonen –90 o indusert bøyning - endrede relative posisjoner –Major groove lukkes, minor åpnes –CAPs effekt gjenskapes av DNA-sekvenser som spontant bøyes

31 To mulige mekanismer Posisjon Bøyning CAP x RNApol.

32 X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (a) CAP–cAMP in complex with a palindromic 30- bp duplex DNA. Page 1241

33 X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (b) CAP– cAMP in complex with a 44-bp palindromic DNA and the  CTD oriented similarly to Part a. Page 1241

34 X-Ray structures of CAP-cAMP complexes. (c) CAP dimer’s two helix- turn-helix motifs bind in successive major grooves of the DNA. Page 1241

35 Sekvens-spesifikk DNA-binding Prinsipper og eksempler

36 Hvordan gjenkjennes sekvens fra utsiden? Elektrostatisk interaksjon Hydrofob interaksjon Hydrogen- bindinger Form/ geometri

37 Komplementære former Dimensjonen til  heliks passer dimensjonene i major groove av B-DNA Sidegruppene peker utover og er gunstig plassert for dannelse av hydrogenbindinger

38 Gjenkjenning via hydrogenbinding Hydrogenbinding er sentral for spesifikk gjenkjenning Hydrogenbindingspotensialet er ikke uttømt i dupleks DNA, ledige seter peker ut mot major groove A DA

39 Heliks-turn-heliks (HTH) motiv er vanlig i prokaryoter HTH = 2  -helikser (120 o kryss) 2.heliks = gjenkjenningsheliks 434 fag repressor

40 Et lignende eksempel - Cro protein fra 434 fag

41 Indirect read-out?

42 Unntak: DNA-binding via  -ribbon Met repressor Arc repressor

43 Arabinose-operonet

44 Stort oppstrøms kontrollområde

45 Kontroll via looping

46 X-Ray structure of E. coli AraC in complex with L -arabinose. Page 1247

47 Trp operon Eksempel på regulering via både initiering og terminering

48 1.nivå: repressor + corepressor Trp repressor binder tryptofan og styrkes som repressor –Logikk: når Trp tilgjengelig, reduseres syntese TrpR + Trp binder operator og inhiberer operonet 70-fold Trp = korepressor (økt represjon) –≠ inducer som svekker represjon

49 Trp repressor - indusert DNA-binding Trp repressor binder sin operator kun i nærvær av tryptofan (rød)

50 Trp repressor

51 2. Nivå: regulering av terminering Trp operon har en lang ledersekvens (trpL)ds Lav Trp: hele den polycistroniske mRNA produseres Høy Trp: en kort versjon lages, prematurt terminert i trpL Attenuator = kontrollelement ansvarlig for prematur terminering

52 Trp-operon

53 Mekanisme for attenuering trpL: 4 segmenter og 2 konformasjoner med ulik effekt 1-2 i en mini-ORF med 2 Trp 3-4 er en klassisk terminator

54 Modell Mye Trp: ribosomet starter straks translasjon og fremmer konformasjonen som gir terminering Lite Trp: ribosomets venting på Trp-tRNA fremmer 2-3 konformasjon som tillater videre transkripsjon

55 Samspill mellom ribosomet og Trp-tRNA

56 Amino Acid Sequences of Some Leader Peptides in Operons Subject to Attentuation. Page 1253

57 Gener for ribosomalt RNA i E. coli rRNA i bakterier: 23S, 16S og 5S Under optimale vekstforhold inneholder en bakteriecelle rundt ribosomer Dersom det var bare en kopi av genene for rRNA ville det kun være rundt 1200 ribosomer/celle E. coli-genomet inneholder 7 separate rRNA- operoner, hvert med en kopi av hvert gen

58 Stringent respons Eksempel på regulering via signalmolekyl som speiler vekstforhold

59 ppGpp Stringent respons: ved aminosyremangel skjer en metabolsk tilpasning hvor rRNA- og tRNA-syntesen reduseres fold Ved stringent respons akkumuleres ppGpp Syntese: relA (stringent faktor) –ATP + GTP = AMP + ppGpp Degradering: spoT


Laste ned ppt "Modell Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer –Forutsagt effekt."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google