Modell Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer Forutsagt effekt.

Presentasjon om: "Modell Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer Forutsagt effekt."— Utskrift av presentasjonen:

1 Modell Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer Forutsagt effekt av GTP til ITP (svekket terminering) Flere andre forhold bidrar Kontekst, NTP, supercoil osv

2 Assistert terminering - rho-avhengig
Noen termineringsseter krever en hjelpefaktor (rho-faktor) Rho = Hexamer NTPase som katalyserer opptvinning (unwinding) Modell Rho binder RNA oppstrøms via et spesifikt motiv, migrerer mot polymerasen, opptvinning, frigjøring av transkript

3 Rho factor. Page 1231 The Rho protomer with its N-terminal domain cyan, its C-terminal domain red, and their connecting linker yellow.

4 Rho factor. Page 1231 The Rho hexamer. Its six subunits, each of which are drawn in a different color, form an open lock washer-shaped hexagonal ring.

5 Rho factor Page 1231 The solvent-accessible surface of the Rho hexamer as viewed from the top of Part b.

6 Hvordan regulere transkripsjon?
Behov for regulering: Nivå: Noen mRNA trenges i store mengder, andre i små Timing: Forskjellige mRNA trenges til ulike tidspunkt Respons: Noen mRNA trenges bare i visse miljø (nærvær av ulike næringsstoffer) Hvordan oppnås ulike transkripsjonsnivå?

7 Rask endring i prokaryoter
Koblet translasjon /transkripsjon gir respons innen minutter Translasjon av mRNA før transkripsjon er ferdig mRNAs levetid også kort (1-3min)

8 Enkel regulering av NIVÅ via ulike optimale promotere
lacI genet er lavt uttrykt pga svak promoter (avvik fra consensus) <10 mlk pr celle Svak Svak 10000 mlk pr celle Sterk Sterk

9 Regulering av TIMING - serie av sigma-faktorer
Utvikling/differensiering = tidsmessig ordnet ekspresjon av gen-programmer Fag-infeksjon - enkel modell for slik timing Early - middle - late genes B.subtilis infisert av fagen SP01 Early genes - via vertens RNAP/s - normale promotere Et tidlig produkt = sgp28 en ny s med endret promoterpreferanse Middle genes - via vertens RNAP/sgp28 - egne promotere Late genes - via vertens RNAP/sgp33/34 - egne promotere

10 Regulering av RESPONS - via repressorer (og aktivatorer)
Prokaryot transkripsjons-regulering via tre elementer: Promotere gjenkjennes av RNA polymerasen Operatorer gjenkjennes av repressorer Positive kontrollelementer gjenkjennes av aktivatorer

11 Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter
Aktiviteten av en promoter in vivo i fravær av regulatoriske sekvenser og aktivatorer/repressorer Prokaryoter: grunntilstand = åpen Ingen begrensning på RNA polymerasens tilgang til promotere Repressorer blokkerer tilgang Aktivatorer kun nødvendige på visse svake promotere Eukaryoter: grunntilstand = lukket (pga kromatin) En sterk core-promoter alene er inaktiv i eukaryoter De fleste eukaryote gener krever aktivatorer

12 Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter
Prokaryoter Eukaryoter

13 Eksempel på repressorregulering av promotertilgang
Lac operon Eksempel på repressorregulering av promotertilgang

14 Induksjon- tilpasning til næring
E.coli lager enzymer for laktosefermentering kun når laktose er til stede + lactose - rask induksjon av galaktosid permease ß-galaktosidase Inducer = 1,6-allolactose Lab:IPTG

15 Genetisk kartlegging Operon Strukturelle gener Operator Promoter
Proteinkodende Operator Bindingssekvens for regulator Promoter Bindingssekvens for RNA polymerase

16 Evidens for repressor Konstitutive mutasjoner – lac-operonet aktivt i fravær av inducer Mutasjon mappet til lacI genet lacI ligger utenfor operonet lacI virker i trans via kodet protein-produkt (lac repressor) Oc mutasjoner samme effekt men virker i cis (operator mutasjon)

17 Konjugasjon - evidens for at lacI virker i trans
I+Z+ I-Z- Uten inducer ß-gal syntese starter pga Z+ Represjon forsinket Pga lacI virker i trans

18 The nucleotide sequence of the E. coli lac promoter–operator region.
Page 1239

19 Systemet Uten inducer: AV Med inducer: PÅ
Lac-repressor binder operator Med inducer: PÅ Lac-repressor inaktiveres av inducer

20 Lac repressor Tetramer Hver monomer binder IPTG
Kd = 10-13M Tetramer Hver monomer binder IPTG DNA gjenkjenning via sliding Raskere enn diffusjon IPTG Kd = 10-6M

21 Mekanisme for Lac represjon
Lac operator og promoter overlapper - trolig at repressor blokkerer tilgang for RNA pol Likevel, noe mer

22 X-Ray structure of the lac repressor subunit.
Page 1248

23 X-ray structure of the lac repressor-DNA complex.
Page 1249

24 NMR structure of the lac repressor-DNA complex.
Page 1249

25 Model of the 93-bp DNA loop formed when lac repressor binds to O1 and O3.
Page 1250

26 Eksempel på aktivering av gener via CAP-cAMP komplekset
Katabolittrepresjon Eksempel på aktivering av gener via CAP-cAMP komplekset

27 Glukoses forrang Glukose foretrukket metabolitt Katabolitt represjon
nærvær av glukose hindrer uttrykk av gener nødvendige for annen fermentering (laktose, arabinose, galaktose) Hvordan senses høy/lav glukose? via cAMP! Glukose senker cAMP-nivået

28 Eksempel på katabolittrepresjon – lac-operonet
Lac-operonet ”skrus på” av laktose Lac-operonet ”skrus av” av glukose Katabolitt represjon Induksjon

29 CAP eller CRP Respons overfor cAMP skjer via CAP cAMP-bindende dimer
= Catabolite gene activator protein Kalles også CRP (cAMP receptor protein) cAMP-bindende dimer Endrer konformasjon ved binding av cAMP 90o

30 Mekanisme for aktivering?
CAP kan kontakte RNA pol direkte CAP binder oppstrøms initieringskompleks De to bindes i løsning CAP endrer DNA-konformasjonen 90o indusert bøyning - endrede relative posisjoner Major groove lukkes, minor åpnes CAPs effekt gjenskapes av DNA-sekvenser som spontant bøyes

31 To mulige mekanismer Posisjon Bøyning CAP x RNApol.

32 X-Ray structures of CAP–cAMP complexes
X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (a) CAP–cAMP in complex with a palindromic 30-bp duplex DNA. Page 1241

33 X-Ray structures of CAP–cAMP complexes
X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (b) CAP–cAMP in complex with a 44-bp palindromic DNA and the aCTD oriented similarly to Part a. Page 1241

34 X-Ray structures of CAP-cAMP complexes
X-Ray structures of CAP-cAMP complexes. (c) CAP dimer’s two helix-turn-helix motifs bind in successive major grooves of the DNA. Page 1241

35 Sekvens-spesifikk DNA-binding
Prinsipper og eksempler

36 Hvordan gjenkjennes sekvens fra utsiden?
Elektrostatisk interaksjon Form/ geometri Hydrogen- bindinger Hydrofob interaksjon

37 Komplementære former Dimensjonen tilheliks passer dimensjonene i major groove av B-DNA Sidegruppene peker utover og er gunstig plassert for dannelse av hydrogenbindinger

38 Gjenkjenning via hydrogenbinding
Hydrogenbinding er sentral for spesifikk gjenkjenning Hydrogenbindingspotensialet er ikke uttømt i dupleks DNA, ledige seter peker ut mot major groove D A A

39 Heliks-turn-heliks (HTH) motiv er vanlig i prokaryoter
HTH = 2 a-helikser (120o kryss) 2.heliks = gjenkjenningsheliks 434 fag repressor

40 Et lignende eksempel - Cro protein fra 434 fag

41 Indirect read-out?

42 Unntak: DNA-binding via b-ribbon
Met repressor Arc repressor

43 Arabinose-operonet

44 Stort oppstrøms kontrollområde

45 Kontroll via looping

46 X-Ray structure of E. coli AraC in complex with L-arabinose.
Page 1247

47 Eksempel på regulering via både initiering og terminering
Trp operon Eksempel på regulering via både initiering og terminering

48 nivå: repressor + corepressor
Trp repressor binder tryptofan og styrkes som repressor Logikk: når Trp tilgjengelig, reduseres syntese TrpR + Trp binder operator og inhiberer operonet 70-fold Trp = korepressor (økt represjon) ≠ inducer som svekker represjon

49 Trp repressor - indusert DNA-binding
Trp repressor binder sin operator kun i nærvær av tryptofan (rød)

50 Trp repressor

51 2. Nivå: regulering av terminering
Trp operon har en lang ledersekvens (trpL)ds Lav Trp: hele den polycistroniske mRNA produseres Høy Trp: en kort versjon lages, prematurt terminert i trpL Attenuator = kontrollelement ansvarlig for prematur terminering

52 Trp-operon

53 Mekanisme for attenuering
trpL: 4 segmenter og 2 konformasjoner med ulik effekt 1-2 i en mini-ORF med 2 Trp 3-4 er en klassisk terminator

54 Modell Mye Trp: ribosomet starter straks translasjon og fremmer konformasjonen som gir terminering Lite Trp: ribosomets venting på Trp-tRNA fremmer 2-3 konformasjon som tillater videre transkripsjon

55 Samspill mellom ribosomet og Trp-tRNA

56 Amino Acid Sequences of Some Leader Peptides in Operons Subject to Attentuation.
Page 1253

57 Gener for ribosomalt RNA i E. coli
rRNA i bakterier: 23S, 16S og 5S Under optimale vekstforhold inneholder en bakteriecelle rundt ribosomer Dersom det var bare en kopi av genene for rRNA ville det kun være rundt 1200 ribosomer/celle E. coli-genomet inneholder 7 separate rRNA-operoner, hvert med en kopi av hvert gen

58 Eksempel på regulering via signalmolekyl som speiler vekstforhold
Stringent respons Eksempel på regulering via signalmolekyl som speiler vekstforhold

59 ppGpp Stringent respons: ved aminosyremangel skjer en metabolsk tilpasning hvor rRNA- og tRNA-syntesen reduseres fold Ved stringent respons akkumuleres ppGpp Syntese: relA (stringent faktor) ATP + GTP = AMP + ppGpp Degradering: spoT