Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

INGRID RANDEN 2011 1 Molekylærbiologiske metoder.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "INGRID RANDEN 2011 1 Molekylærbiologiske metoder."— Utskrift av presentasjonen:

1 INGRID RANDEN Molekylærbiologiske metoder

2 Utvalgte molekylærbiologiske metoder 2 PCR (konvensjonell og ’real time’) SNP analyser Sekvensering RFLP Southern, Northern og Western blotting Plasmid og ekspresjonskloning FISH Mikromatriser RNA interferens

3 3 Molekylærbiologiens historie 1953Watson & Crick: DNA dobbelheliks 1966Nirenberg, Mattaei, Khorana & Holley: Genetiske kode 1972Berg: Første rekombinante DNA-molekyl 1975Southern: Blotting 1975Sanger: DNA-sekvensering 1978Botstein: RFLP 1982Augenlicht & Kobrin: Mikromatriser 1985Mullis: PCR 1990HUGO lanseres 1996Dolly klones 2001Humane genom publiseres 2001Bass: RNAi

4 PCR: 4 Renser (kloner) en bit av DNA vekk fra resterende genom Renset DNA kan brukes til:  Sekvensering  Diagnostikk av genetiske sykdommer  Deteksjon av virale infeksjoner  Identifisering av liten mengde materiale – rettsmedisin  SNP analyser (med mer) Kvantitering av DNA eller mRNA (’Real time’ PCR)

5 Hva må til for å kjøre PCR? 5 Templat: DNA (ev. mRNA) Primere Deoksynukleotider (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Taq polymerase Reaksjonsbuffer ([Mg 2+ ] er viktig!) PCR maskin (Thermocycler)

6 6

7 Primerdesign er viktig for PCR: 7 Primere skal være komplementære til DNA Alltid 2 primere; en for hver side av DNA-stykket som skal amplifiseres (kalles ”forward” og ”revers” ev. sense og antisense) Primere skal være spesifikke, dvs. ingen homologi med annet DNA Typisk lengde: baser Smeltetemperaturen, T m, skal være likest mulig for de to primerne.

8 Deteksjon av PCR produkter skjer ved farging av det amplifiserte DNA med ethidiumbromid og elektroforese i en agarose gel 8

9 PCR er en eksponensiell amplifisering 9

10 Konvensjonell PCR sammenlignet med ’real time’ 10 Konvensjonell PCR er en endepunktsdeteksjon:  Dårlig presisjon  Lav oppløselighet  Lav sensitivitet  Ikke automatisert (må kjøre gel for å få resultatet)  Resultatet er ikke numerisk uttrykt  Ethidiumbromid-farging er ikke særlig kvantitativt

11 Kvantitering ikke mulig med konvensjonell PCR. 11 Ethidium bromid farging av gel etter konvensjonell PCR ’Real time’ PCR hvor økning i PCR-produkt kan følges på skjerm

12 12 Deteksjon skjer ved et fluorescens-signal vist på skjerm under PCR-reaksjonen  slipper gel-elektroforese og ethidium bromid Fluorescens-signalet er proposjonalt med mengde DNA  kvantitativt mål for mengde DNA i utgangsmaterialet Hybridiseringsprober i tillegg til primere  konfirmasjon av PCR-produktets identitet Hybridiseringsprober er spesielt godt egnet til smeltepunktsanalyse og mutasjonsdeteksjon ’Real time’ PCR (Eks. Lightcycler)

13 SNP (single nucleotide polymorphism): 13 SNP finnes i gjennomsnitt 1/1000 baser i det humane genom Viktige redskap for genetisk testing, identifisering av sykdomsgener og farmakagenomikk Ønskelig med raske metoder som kan undersøke store DNA-områder på kort tid

14 14 Mutasjonsdeteksjon: Deteksjonsproben må dekke mutasjonsstedet og være komplimentær til vill-typen

15 Mutasjonsdeteksjon: 15 Hybridiseringsprobens T m avhenger av homologi med templatet En probe med én mismatch i forhold til templatet vil smelte av ved lavere temperatur enn en probe med 100% homologi

16 16 Ved sakte heving av temperaturen vil proben med laveste smeltetemperatur, T m, dvs. dårligste komplimentaritet med templatet, smelte av først. Dette detekteres som et fall i fluorescence fordi probene ikke lenger er nær hverandre.

17 Sekvensering : (Sanger, F. et al., J Mol Biol 1975; 94, 441) 17 Forutsi aminosyresammensetningen i proteiner Kartlegge gener (HUGO) Identifisere exons (proteinkodende regioner) innen gener Identifisere regulatorområder (promotor, enhancer etc.) Identifisere konserverte sekvensmotiv mellom arter Identifisere SNP (med mer)

18 Sanger sekvensering : (Chain terminator method) 18 To trinns prosess:  DNA som skal sekvenseres er templat for enzymatisk syntese av nytt DNA. Syntesen begynner ved et definert primersete  Inkorporering av dideoksy-nukleotider stopper reaksjonen (tilfeldig)

19 Hva må til for å sekvensere? 19

20 20 Deoksynukleotider er byggesteinene i DNA molekylet Dideoksynukleotider mangler 3’-OH-gruppe Inkorporering av et dideoksynuklotid stanser polymerisering Reaksjonen kjøres med dNTP/ddNTP > 1

21 Merking med fluorescein : Ikke radioaktivitet, en kolonne på gelen, og automatisering 21 Til venstre : Radioaktiv sekvensering hvor fire sekvenseringsreaksjoner kjøres parallelt. DNA separeres ved elektroforese på en polyacrylamid /urea-gel. DNA-båndene visualiseres ved røntgen-film og sekvensen leses nedenfra Til høyre: Dye-terminator sekvensering. Hver av dideoksynukleotidene merkes med ulik fluoriscerende farge og kan kjøres i samme sekvenseringsreaksjon

22 22 © 2003 by Steven M. CarrSteven M. Carr Sekvensering brukt til mutasjonsdeteksjon

23 23 RFLP: Restriction fragment length polymorphism Gammel molekylærbiologisk metode: * Screening av sykdomsgener * DNA-fingeravtrykk i rettsmedisin Fordel: Meget nøyaktig

24 Prinsipp for RFLP: 24 Restriksjonsenzym EcoRI

25 25 Digestion Restriction DNA Fragments Apply to Gel Electrophoresis Southern Blotting DNA Fragments on Membrane Hybridized FragmentsAutoradiogram or Lumigram RFLP metode:

26 26 Sigd-celle anemi: RFLP identifiserer SNP: Arvelig recessiv sykdom hvor glutaminsyre i posisjon 6 i beta-kjeden av hemoglobinet er byttet ut med valin SNP-en gjenkjennes av et restriksjonsenzym Syk, CCTGTGG Frisk, CCTGAGG

27 27 Southern blot: Dobbelttrådet DNA-fragmenter separeres på gel Nitrocellulosepapir eller nylonmembran legges over gelen og papirhåndklær legges på toppen. Bufferen trekkes i gjennom mens den denaturerer DNA slik at enkelttråder fester seg på nitrocellulosen. Nitrocellulosen fjernes forsiktig fra gelen. Nitrocellulosepapiret legges i en buffer som inneholder radioaktivt merket probe. Papiret vaskes grundig slik at bare probe som er bundet til DNA er tilbake. Papiret legges sammen med en film som svertes der hvor proben har bundet seg. Northern blot fungerer på samme måte, men med sekvenser spesifikke for mRNA i stedet for DNA

28 28 DNA kloning 111yy111yy 112yy112yy 4 113yy113yy 115yy115yy 116yy116yy

29 29 Protein Ekspresjonskloning

30 FISH: fluorescence in situ hybridization 30 Lokalisering av gener på kromosomer Deteksjon av kromosom abnormaliteter:  aneuploiditet  translokasjoner  mikrodelesjoner

31 Prinsipp for FISH: 31

32 Interfase (kjerne)-FISH: aneuploiditets test 32 Trisomi 21: Grønn = kromosom 13, Rød = kromosom 21

33 33 Metafase-FISH: Deteksjon av BRCA2 på kromosom 13

34 Mikromatriser 34 Kvantitere og sammenligne genekspresjon i stor skala Brukt mye til klassifisering av maligne sykdommer Øyeblikksbilde/tidsstudier (for eks. cellesyklus) Tidkrevende og dyrt – planlegg nøye: MIAME = minimum information about a microarray experiment (http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html)

35 35 pga.maw.edu/pga/jsp/components/education/CHS_2001_Kwitec

36 36 Rødt representerer kontroll cDNA Grønt representerer prøve cDNA Gult representerer en kombinasjon av prøve og kontroll hvor begge hybridiserer likt til proben Svart representerer områder hvor verken prøve eller kontroll har bundet seg

37 37 Hierarkisk clustering: Dendrogram som baserer seg på at co-ekspresjon indikerer co-regulering Korte grener indikerer høy korrelasjon Lange grener indikerer lav korrelasjon

38 38 From the following article: Common markers of proliferation Michael L. Whitfield, Lacy K. George, Gavin D. Grant and Charles M. Perou Nature Reviews Cancer 6, (February 2006) Hvor mange gener er involvert i cellesyklus- regulering? Studier av HeLa cellelinjen viste at 850 gener har periodisk ekspresjon gjennom cellesyklus.

39 To-farge kontra en-farge mikromatriser 39

40 40 Affymetrix, Applied Microarrays, Eppendorf En-kanal Måler absolutt nivå av genekspresjon Har samme probe på flere forskjellige steder på chipen Har prober med ”perfect match” (PM) til genet og prober med en ”mismatch” (MM) i midten av proben – kan korrigere for uspesifikk binding To-kanals Måler relativ forskjell i genekpresjon Foretrukket for målinger mellom forskjellige typer vev, tidspunkter etc Agilient, Eppendorf, Telechem

41 41 Translasjonskontroll  mRNA ødelegges vha sekvensspesifikk degradering Resultat  Redusert / ingen genekspresjon Brukes til  Genfunksjonsstudier RNA interferens (RNAi):

42 42 1) Lange dsRNA -biter transfekteres inn i cellen 2) Dicer (RNAse III enzym) kutter dsRNA inn i mindre biter (siRNA) 3) siRNA biter (21-25 nt lange) binder seg til RNA- inducing silencing complex (RISC) 4) siRNA denatureres (vha ATP), RISC aktiveres og binder mål-mRNA. Subenheter av RISC kutter mRNA 5) Andre proteiner degraderer mRNA ytterligere og hindrer ekspresjon av målproteinet

43 43 Eksempel på ”knock out” av enzymet GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) ved hjelp av RNAi i HeLa celler: I venstre panel: Tilfeldig siRNA introdusert (ikke komplementært til GAPDH mRNA) I høyre panel: siRNA komplementært til GAPDH slår ut mRNA og proteinet blir ikke uttrykt Rødt: Merket siRNA Blått: Kjernefarging Grønt: GAPDH protein


Laste ned ppt "INGRID RANDEN 2011 1 Molekylærbiologiske metoder."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google