Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

KJB220 Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "KJB220 Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase."— Utskrift av presentasjonen:

1 KJB220 Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Kvantitering av spesifikke mRNAs Forsøk 1 Forsøk 2 Forsøk 3 ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) PP1 Test av celletype- spesifikk mRNA c-myb Real-time PCR Lightcycler Oversikt over oppgaven

2 KJB220 Ulike mønstre av mRNA uttrykk Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA  Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener)  Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA cDNA Referanse Ukjent Kvantitering

3 KJB220 The quantitative assay - step by step Primer design RNA isolation cDNA synthesis Set up of the experiment Programming and running the LightCycler Optimizing the PCR reaction Interpretation of the results Troubleshooting

4 KJB220 Stage 1: Primer design Length: bp  Try to make the two primers equal in length GC content:  Between 40% and 60% with equal GC content in both primers  Avoid an unbalanced distribution of G/C and A/T-rich domains Sequence:  3´-region most important, free of secondary structures, repetive sequences, palindromes, and highly degenerate sequences  Last 5 nucleotides should contain no more than 2 G/C Melting temperatures  Tm = temp at which 50% of the primer-target hybrids are single stranded.  Depends on primer sequence and buffer composition  Tm between o C, primers used together should have similar Tm value

5 KJB step: RNA isolation Several methods  GTC metoden  Trizol metoden  Ulike kommersielle kit Kits for cultured cells  5 x 10 6 cells/prep,  expected yield: ug/ 10 6 cells

6 KJB220 Arbeid med RNA er krevende pga RNA lett degraderes RNA er et labilt molekyl som lett degraderes  Pga 2´-OH som deltar i degraderings- mekanismen  Pga RNAser som finnes overalt (fingre etc) og som er svært robuste enzymer (noen tåler koking).  RNA er derfor langt mer ustabilt enn DNA  I cellene er mRNA beskyttet dels med ende-modifikasjoner, dels via assosiasjon med protein Arbeid med RNA krever derfor særlig forsiktighet cap AAAAAAAAAAAAA Pre-mRNA (hnRNA) mRNA

7 KJB220 Tiltak for å unngå RNA degradering Unngå RNaser (allestedsnærværende)  Bruk hansker (men ha ikke blind tiltro til hvor effektive de er)  Løsninger behandles med DEPC (diethylpyrocarbonate)  Bruk RNase-frie rør og pipettespisser (helst med filter)  Elektroforesekar behandles med H 2 O 2  Glass og metall varmebehandles: 180 o C minst 8 timer Bruk RNase inhibitorer  DEPC (diethylpyrocarbonate) er et reaktivt alkyleringsagens  Vanadyl ribonucleoside komplekser - ikke-kovalent inhibitors, må fjernes før RNA skal brukes videre pga inhibering av polymeraser  Protein inhibitorer - et ca 50 kDa cytoplasmatisk inhibitor protein isolert fra placenta binder sterkt til og inhiberer mange Rnaser (kommersielle navn: RNasin, prime inhibitor etc)

8 KJB220 Inhibitorer av Rnaser - DEPC DEPC (diethylpyrocarbonate)  DEPC er et reaktivt alkyleringsagens som inaktiverer RNaser i buffere og på glassutstyr.  Modifiserer Histidine grupper med ethoxyformyl  DEPC reagerer med RNA og protein generelt, og kan derfor ikke brukes under isolering.  Inaktiveres raskt i vann (halveringstid ca 10 min ved pH 7) og omdannes til CO 2 og etanol. Bør ikke brukes sammen med Tris.  Bruk: 0.1% DEPC i vann overnatt ved rom temp (eller 1 time 37 o C) etterfulgt av vask med DEPC-behandlet vann og autoklavering C-CH 2 -CH 3 O O O

9 KJB220 Hvordan isolerer vi RNA? Kit for RNA isolering  The Absolutely RNA TM RT-PCR miniprep kit Prinsipp  Celler lyseres i nærvær av guanidin thiocyanat, en av de sterkeste kjente protein denaturanter, som inaktiverer Rnaser  Pre-filter spin fjerner partikler og noe DNA  RNA blir absorbert til en silika-basert fiber-matriks i nærvær av høye konsentrasjoner chaotropiske salter (mens kontaminanter vaskes ut).

10 KJB220 Hvordan isolerer vi RNA? Prinsipp forts.  Vask med lav-salt buffer  Rester av DNA fjernes med DNase behandling  Videre vask fjerner protein og rester av DNase  Høy-renset RNA isoleres i et lite volum ved eluering med en buffer med lav ionestyrke og samles opp i mikrosentrifuge-røret Renset RNA  Har lavere DNA-innhold enn mange metoder  Er derfor velegnet for RT-PCR og real-time PCR analyser

11 KJB step: cDNA synthesis Omdanning av mRNA til cDNA Ulike kommersielle RT-enzymer  Omniscript RT-kit (Qiagen)  Kit from Roche: Master RNA Cybergreen  Superscript (Life Technol.) mRNA oligo dT RT: Reverse transcriptase cDNA mRNA 5´ 3´ 5´ 3´ Templat for Real-time PCR cap AAAAAAAAAAAAA mRNA

12 KJB220 Reaction mix for the LightCycler Template DNA  cDNA from 50 ng total RNA, diluted 1:10 or 1:50 Primers  uM of each primer MgCl 2  1-5 mM Nucleotides, Taq PCR buffer, Taq DNA Polymerase  Included in the LightCycler DNA Master SYBR Green I

13 KJB220 Samples to run A series of dilutions are made to construct a standard curve for target gene  Using a subclone of the target Sample (cDNA) with primers for target gene  In the form of cDNA made from the isolated RNA Sample (cDNA) with primers for housekeeping genes for normalization purposes

14 KJB220 Standard curve Use at least 3 concentrations for a standard curve Use serial dilutions that are one order of magnitude apart _ 1:10, 1:100, 1:1000,... For medium and high concentrations, a single point per concentration is sufficient

15 KJB220 Programming the Lightcycler

16 KJB220 Programming the Lightcycler Preincubation Denaturation Amplification  Denaturation, annealing (primer dependent), elongation (bp/25 sec), cycle number (may be increased during run) Melting curve  Primer dependent, 5-10 higher than the primer annealing temp Cooling Edit samples

17 KJB220 Optimization - an important step Finding optimal MgCl 2  Find conc (1-5 mM) that gives best crossing point, signal intensity and slope Annealing temperature?  Try to design primers with similar Tm, allows standard conditions of annealing temp Controls - positive and negative  Always include a NTC (non template control, here water) to see primer-dimers  Also include a positive control to see that the reaction works

18 KJB Optimizing PCR conditions Template dilution  Use dilution that gives crossing points in the range Programming  Annealing temp, elongation time Improve your primer design?  If difficult to optimize, order new primers (much cheaper than long optimalization experiments)

19 KJB220 Interpretation of the results Quantification by one or several standard curves Ratio: target gene/housekeeping gene in each sample  Assumption: housekeeping gene expression = constant in the samples  Normalisation of the total cDNA using constitutively expressed housekeeping genes Jurkat/Myb = Jurkat/PP1 HeLa/Myb = HeLa/PP1

20 KJB220 Interpretations of the results Evaluation Parameters  Error < 1  r =  Slope Melting curve analysis  Primer dimers  Expected melting point Calculations E = 10 -1/slope E = 10 -1/ = 1.97 Jurkat/Myb = Jurkat/PP1 HeLa/Myb = HeLa/PP1 22 fold

21 KJB220 Troubleshooting: Problem 1: primer dimers Primer-dimers interferes with quantitation  LC with SYBR-green measures all DNA produced  Primer-dimer is a template-independent product that also produces fluorescence Identifying primer-dimers: melting curve analysis  Pure, homogenous PCR products produce a single, sharply defined melting curve with a narrow peak. Primer dimers melt at relatively low temperatures and have broader peak

22 KJB220 How to avoid primer/dimers? General approaches  Reduce delays in workflow  Optimize primers - may be more important with LC than in conventional PCR  Increase the annealing temperature Reduce annealing time to 1-5 sec.  Use hot start inactive modified enzyme/Ab-bound enzyme that becomes activated after heat exposure LC-specific approaches  Increase the temperature for fluorescence registration  Use of hybridization probes rather than SYBR-green  Reduce number of cycles, e.g. to

23 KJB220 Problem 2: RNA contaminated with genomic DNA Identify by running ± reverse transcriptase, compare Cps Traces of genomic DNA will work as templates interfering with quantitation, may reduce reproducibility

24 KJB220 How to avoid problems with genomic DNA? Always include a DNase I purification step in the RNA isolation procedure  Included in the kit used here Always run a ±reverse transcriptase reaction to check the quality of the RNA  Used as the first experiment here

25 KJB220 Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Kvantitering av spesifikke mRNAs Forsøk 1 Forsøk 2 Forsøk 3 ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) PP1 Test av celletype- spesifikk mRNA c-myb Real-time PCR Lightcycler Mandag

26 KJB220 Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase Kvantitering av spesifikke mRNAs Forsøk 1 Forsøk 2 Forsøk 3 ±RT for å sjekke kvaliteten av RNA Test av referanse-mRNA (husholdningsgen) PP1 Test av celletype- spesifikk mRNA c-myb Real-time PCR Lightcycler Tirsdag

27 KJB220 Ulike mønstre av mRNA uttrykk Ulike celler uttrykker et spektrum av mRNA  Noen er de samme i alle celler og blir uttrykt i rimelig like mengder overalt (husholdningsgener)  Andre er spesifikke for noen få celletyper og bidrar til disse cellenes særlige egenskaper (celletypespesifikke gener). I real-time kvantitering av mRNA brukes de første som referanse mRNA cDNA Referanse Ukjent Kvantitering

28 KJB220 Criteria for single standard curve Equal Efficiency Required for Accurate Analysis Prerequisite : Efficiency Standard = Efficiency Target Efficiency depends on: - fragment length - advantage with short PCR-products ( bp) - intervening sequence l - spacing RT primer to PCR primer - advantage to design primers in the 3´-part of the gene l

29 KJB220 Prerequisites of a suitable housekeeping gene RNA-specific detection  pseudogene free  amplification / detection specific for active target No regulation of expression level in the system analysed  normal vs. tumor tissue  unstimulated vs. stimulated cells Similar expression level compared to the target analysed

30 KJB220 Housekeeping Genes ß-actinmultigene family; > 20 genes; 1 active locus  : hormones of tyroid gland 20 pseudogenes  : stomach tumor  -actinmultigene family; pseudogenes GAPDHmultigene family; genes; > 200 in mouse  : lung, pancreatic, colon cancer mostly pseudogenes  : insulin, EGF 5.8S,18S, 28S RNApseudogenes ß2-microglobulinno pseudogenes  : Non-Hodgkin lymhoma abnormal expression in tumors G6PDHno pseudogenes  : kidney, stomach tumor  : hormones, oxidant stress, growth factors PBGDno pseudogenes aldolasepseudogenes HPRTpseudogenes U3, U8,...Pseudogenes ornithin  : tumors decarboxylase... GeneGenomic structure / pseudogenesRegulation e.g.


Laste ned ppt "KJB220 Jurkat celler (T-lymfocytter) HL60 celler (Myeloide celler) HeLa celler (Cervix celler) RNA isolering RT: cDNA-syntese med revers transkriptase."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google