RNA-interferens.

Presentasjon om: "RNA-interferens."— Utskrift av presentasjonen:

1 RNA-interferens

2 «Junk DNA» Human genome project 1,5 % av genomet koder for proteiner
Hva med resten? Ikke-kodende? Søppel? Genregulering Epigenetisk regulering

3 Cytoplasma

4 RNA Det finnes store mengder RNA som ikke translateres videre til proteiner: Ribosomalt RNA Transfer-RNA Ribozymer Interferende RNA-molekyler Sistnevnte har vært kjent siden 70-tallet, men har vært avfeid som små degradasjonsprodukter

5 RNA-interferens siRNA (små interfererende RNA) Mikro-RNA Mellomformer

6 siRNA Antatt fylogenetisk eldst. Forsvar mot virus eller andre innkommende genetisk elementer. Antatt å være viktigst for leddyr, nematoder, planter og sopp Oftest eksternt dobbelttrådet RNA (viralt RNA) som kuttes opp 21-25 bp med to overhengende baser i hver ende 100% match med målsekvens – fører til destruksjon av mål-RNA Innkommende RNA blir brukt som våpen mot «seg selv»

7 siRNA «Primitivt» immunsystem Spesifikt forsvar mot infeksiøse agens
Hukommelse?

8 Mikro-RNA Reguleringsmolekyl som dannes av cellen selv
Foldet struktur med hårnål-former som kuttes opp Ikke nødvendigvis 100% match med målsekvens (hyppigst 100% hos planter, sjelden hos pattedyr 19-23 bp, med 2 overhengende baser i hver ende Antatt å være viktigst hos planter og mennesker Utgjør 2-3% av det humane genom, og antas å være involvet i regulering av ca 30% av humane gener.

9 Oppdagelsen Petunia Tilførsel av pigmentgen med kraftig promotor ga uventet effekt: Førte til at mange planter delvis mistet fargen helt. Både tilført gen og plantens eget ble inaktivert. Kalt ko-suppresjon (Napoli 1990)

10 Oppdagelsen forts. Caenorhabditis elegans
(Fire 1998). RNA hadde da blitt sirklet inn som sannsynlig substrat. Fire gjorde de avgjørende forsøkende på C. elegans og påviste at korte komplementære dsRNA-fragmenter var tilstrekkelig for å gi tilsvarende effekt på proteinsyntesen hos denne organismen. Mange viktige oppdagelser siden har vært gjort under forsøk med C. elegans.

11 RNAi-apparatet Dicer RISC
Argonaut (subenheten som står for kuttingen i RISC)

12 Mikro-RNA

13 siRNA

14 Unntakene Endogene siRNA (av gener med mange repetitive regioner)
involvert i kromatinregulering Exogene miRNA Flere DNA-virus (F.eks. CMV) koder for miRNA-molekyler som kan hemme cellens antivirale respons) shRNA Bioteknologisk løsning der man lager små RNA-molekyler som danner én enkelt hairpin som kan fungere som siRNA. Dannes ved transkripsjon av f.eks. plasmid i målcellen.

15 Anvendelse Forskningsverktøy Behandling: Gen-knockdown i cellekulturer
Syntetiske dsRNA med ønsket spesifisitet Plasmider eller virus (retrovirus, AAV) som vektor Behandling: Virale infeksjoner Kreft Degenerative sykdommer

16 Virale infeksjoner RSV Knockdown av RSV’s N-protein (nukleoprotein)
siRNA tilført med nesespray Fase 2-studie (DeVincenzo 2010) 88 pasienter, randomisert, dobbeltblind 38% reduksjon i antall dyrkningsbekreftede RSV-infeksjoner (p=0,009)

17 Virale infeksjoner Hepatitt C
En rekke in vitro-forsøk har vist meget god effekt Levering av molekylet til leveren er en utfordring Bæremolekyler (lipider, apolipoprotein m.m.) På forsøksstadiet microRNA-122 (miR-122) er viktig for HCV-translasjon (uviss mekanisme) Helsyntetiske nukleinsyresekvenser (LNA) er benyttet på sjimpanser med HCV-infeksjon. Ga markant virus-suppresjon. Fase 1-studie på mennesker på gang

18 Cancer Cancer pancreatis Familiær tykktarmspolypose
Knockdown av KRAS-genet med siRNA tilført i biodegraderbare polymerer. Injisert direkte i tumoren. Fase 2-studie på gang Familiær tykktarmspolypose Knockdown av beta-katenin med siRNA produsert av rekombinant E.coli tilført peroralt. Gode resultater i dyreforsøk. Fase 1 på gang.

19 Nevrodegenerative sykdommer
Huntingtons sykdom Knockdown av htt (huntingtonproteinet) Museforsøk. shRNA-gen satt inn i adenoassosiert virus. Injisert IV Signifikant symtomreduksjon og reduksjon av patologiske lesjoner i hjerne.

20 Fordeler Små doser – få bivirkninger Lett å designe og produsere
Spesifikk effekt

21 Utfordringer RNA-levering til målorgan Nukleaser i vev
Immunaktivering (via TLR) Off target effects Escape-mutasjoner Levertoksisitet i høye doser

22 Oppsummering

23 CRISPR Lignende system hos bakterier
Utgangspunktet er her DNA-molekyler Forsvar mot bateriofager eller plasmider Biter av innkommende DNA blir brukt som våpen mot andre identiske sekvenser Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)

24