Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

Granulocyttfunksjons undersøkelser

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "Granulocyttfunksjons undersøkelser"— Utskrift av presentasjonen:

1 Granulocyttfunksjons undersøkelser
Haakon Sjursen Universitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus 2013 H.Sjursen

2 Celler i blod Celle type Celler/mm3 Funksjon Erythrocytter
4.8 – 5.4 x 106 Transport av O2 og CO2 Granulocytter (ca 1 per 1000 røde) Nøytrofile 70% Fagocytose Basofile 1% Histaminproduksjon Eosinofile 4% Toksiner mot parasitter Noe Fagocytose Monocytter/ Makrofager 5% Lymfocytter 20% B celler: Antistoff produksjon T celler: Cellemediært immunitet Plater Blod koagulasjon H.Sjursen

3 Den nøytrofile granulocytt
Immunforsvarets raskeste Produksjon > 1 x 1011 /døgn ca kg per 80 åring Rask turnover: ~ 10 t i blod Evt. 1–2 døgn i vev Endestadiecelle: effektorcelle Cytokinprodusent 10-20 døgn i benmarg, dvs. ”reserve” lik ca 20 x mengden i blod Normal utvandring > 100 milliarder daglig Ca /µL perifert blod, økende til x 10 ved alvorlige infeksjoner Aktiverinng f. eks. ved infeksjoner (med så ulike agens som Anaplasma phagocytophilum, Chlamydia pneumoniae og Leishmania major) forlenger levetiden Produserer først og fremst IL-8, som er en viktig kjemoattraktant, særlig for granulocytter, men også (etter mikrobiell stimulering) IL-12, TNFα, CCL3 (MIP-1α) og CCL4 (MIP-1β) Også antigenpresenterende celle! H.Sjursen

4 3 linjer i forsvaret mot infeksjon
(Innate immune defence) H.Sjursen

5 Andre linje forsvar - Fagocytose
Fagocytose Gresk: fago = spise og cyto = celle Fagocytose utføres av nøytrofile og monocytter/makrofager Nøytrofile dominerer tidlig i infeksjonen Makrofager er monocytter som forlater blodbanen og utvikles til makrofager som vandrer i vev Histiocytter er makrofager lokalt i lever, nervesystem, lunger, lymfeknuter, beinmarg o.a. vev H.Sjursen

6 Den nøytrofile granulocytt
Marginasjon «Rolling» langs endotelveggen Adhesjon Migrasjon Diapedese (emigrasjon) Kjemotakse Fagocytose Intracellulært drap NB: kan ha nedsatt funksjon tross normale granulocytter: Ved antistoffmangel eller komplementmangel Bruker overflatereseptorer for disse funksjonene Drap kan foregå oksidativt og ikke-oksidativt: Det dannes oksygen og nitrogenmetabolitter Ulike enzymer finnes i granula av ulike slag Et svært armamentarium med overlapping og ”overkill” kapasitet, derfor sjelden funksjonssvikt H.Sjursen

7 Marginasjon - Adhesjon - Migrasjon - Diapedese
H.Sjursen

8 A neutrophil adheres to the endothelium in a venule (1)
A neutrophil adheres to the endothelium in a venule (1). It extends its pseudopodium between the endothelial cells and migrates towards the basement membrane (2). After the neutrophil has crossed into the tissue, the endothelium reseals behind (3). The entire process is referred to as diapedesis. (Courtesy of Dr I Jovis) H.Sjursen

9 Kjemotakse: Fagocyttene trekkes til Infeksjonsfokus
H.Sjursen

10 Klassisk og alternativ komplement pathways trigger spalting av C3
H.Sjursen

11 Membran Attack Complex (MAC) forårsaker cytolyse
H.Sjursen

12 H.Sjursen

13 H.Sjursen

14 H.Sjursen

15 Reseptorer og signal interaksjoner ved fagocytose av mikrober (Underhill DM, Ozinsky A, Annu Rev Immunol 2002, 20, 825 Mange reseptorer er involvert. Svikt i én reseptorgruppe kan delvis kompenseres om andre reseptorer er normale Som nevnt overkapasitet, hvor svikt i en reseptorgruppe ofte kan kompenseres Men den mer felles intracellulære ”pathway” er mer sårbar H.Sjursen

16 Stadier i fagocytose -1 Adheranse: Fagocyttens plasmamembran fester seg til bakterien Hemmes av kapsel (pneumokokker) og M protein (GAS) Opsonisering: Coating prosess med opsoniner som letter feste Opsoniner: Antistoff og komplement 2. Internalisering: Plasmamembranen på fagocytten danner pseudopoder som omgir mikroben 3. Mikroben omsluttes av en sekk kalt fagosom 4. Intraacellulært drap: Fagosomet fusjonerer med lysosomet og danner fagolysosomet H.Sjursen

17 Phagocytose H.Sjursen

18 Stadier i fagocytose -2 O2 uavhengig
5. Lysosomale enzymer dreper bakterien innen 10 sec – 20 min. O2 uavhengig Lysozym: Ødelegger peptidoglykan i bakteriens cellevegg Lipaser Lactoferrin Proteaser RNAser og DNAser 6. Etter nedbryting dannes residual legemet med ufordøyelig materialer som blir utskilt fra cellen H.Sjursen

19 Oxidativ burst O2 - avhengig a) Myeloperoxidase (MPO)
b) MPO- uavhengig 1. H2O2 2. Superoxid anion O2¯ 3. Hydroxyl radikal OH ¯ 4. Singlet oxygen O2* 5. Ascorbat-peroxid-metall ion 6. Aminosyre oksidasjon 2O2 + NADPH O2¯ + H+ + NADP + 2O2¯ + 2H H2O2 + O2 H.Sjursen

20 H.Sjursen

21 Elektronmikroskopi av en granulocytt som har internalisert
Staphylococcus aureus (S) H.Sjursen

22 Intracellulær lokalisering av bakterier
Fusjon Lysosom B 3 pH=7.4 Fagosom Fagolysosom B 4 B 1 S.aureaus Brucella Salmonella Coxiella burneti pH=5.0 B Chlamydiae Legionella Mycoplasma B 2 B Ingen fusjon med lysosomet Listeria Cytoplasma

23 Intracellulær lokalisering av antibiotika
Cytoplasma Fagosom pH=7.2 Fagolysosom volum 1 to 5% av cellevolumet pH=5.0 Fluoroquinoloner (x2-8) beta-lactamer (x ) Rifampicin (x2) Aminoglycosides (slow) Macrolider (x10-50) Aminoglycosider (x2-4) Tetracykliner Fluoroquinoloner

24 Intracellulær antibiotika aktivitet
Cytoplasma PH 7.2 Fagosom pH 7.2 Listeria Fagolysosom pH 5.0 Fluoroquinoloner beta-lactamer* Rifampicin Aminoglycosider Macrolider God Macrolider Aminoglycosider Lav eller 0 Fluoroquinoloner, Doxycyclin God S aureus Brucella Salmonella Coxiella Chlamydia Legionella Mycoplasma * Husk:Mycoplasma, Chlamydia, Legionella har ikke cellevegg: β-lactamer virker ikke!

25 Fagocyttfunksjons undersøkelser
Måles ved Fagocytose laboratoriet ved Institutt for Indremedisin, Universitetet i Bergen Nasjonal referanse laboratorium Hva måles: Kjemotakse Fagocytose Intracellulært drap Reseptor ekspressjon: Fc- , komplement reseptorer o.a. Hvorfor: Fordi det finnes medfødte og erværvede defekter i alle disse funksjonene H.Sjursen

26 Kjemotakse defekter Normalt: →1.8 mm/t Komplement mangel/defekter
Nedsatt ved: Noen infeksjoner Brannskader Malignitet Underernæring Revmatoid arthritt Diabetes mellitus Komplement mangel/defekter Inhibitorer (SLE o.a. autoimmune sykdomer Cellulær svikt: Chédiak-Higashi syndrom Immunglobulinmangel (IgA, IgG 1-4) Hyperimmunoglobulinemi E (Job’s syndrom) Hypofosfatemi Opsonindefekter Mannan bindende protein (Lectin) mangel H.Sjursen

27 Nøytrofile defekter Defekt i nøytrofil- avhengig immunforsvar Kvantitativ Nøytropeni – den vanligste
Ervervet Medikament indusert Autoimmun Cancer Leukemi Hereditær Familiær benign (etnisk) nøytropeni Infantil genetisk agranulocytose (Severe congenital neutropenia) Cyklisk nøytropeni H.Sjursen

28 Kvantitative Granulocyttfunksjons defekter
Leukemi, aplastisk anemi, nøytropeni, brannskader, sepsis, diabetes, underernæring, AIDS, nyfødte Hyppigere og alvorligere infeksjoner Ofte med spesielle mikrober Rammer ofte mononukleære fagocytter tilsvarende Funksjonsdefekten fører til lite kliniske funn tross fulminant infeksjon Sjelden sepsis og meningitt H.Sjursen

29 Kvalitative nøytrofile defekter
Adhesjonsdefekter Leukocytt adhesions mangel (LAD) Type 1 Integrin mangel Type 2 E-selectin ligand mangel H.Sjursen

30 Defekter i intracellulært srap
Abnormalt respiratory burst Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) Glukose-6-fosfat mangel Granula abnormaliteter Myeloperoxidase mangel Spesifikke granula mangler Chédiak-Higashi syndrom H.Sjursen

31 Nøytrofil og lymfocytt fra en pasient med Chediak-Higashi syndrom.
Store dysmorfe granula (se pil) H.Sjursen

32 Kronisk granulomatøs sykdom (CGD)
1: 250 – (?) 70% x-bundet recessiv Mutasjoner i gener for 4 plasmamembran proteiner Svært nedsatt H2O2produksjon Excessiv inflammasjon med granulomer DHR-test (Dihydro-rhodamin for intracellulært drap) Catalase mindre betydning? Ikke fagocytosen så mye som det intracellulære drap som er svekket H.Sjursen

33 Kronisk granulomatøs sykdom (CGD)
Alvorlige infeksjoner i hud, øre, lunger, lever, bein Gingivitt, aphter Infeksjoner med katalase-produserende mikrober: Staphylococcus aureus Bacillus cepacia Aspergillus Behandling: antibiotika og IFN-γ profylakse H.Sjursen

34 Behandling av granulocytt defekter
Antibiotika profylakse Granulocytt transfusjon (CGD) Beinmargs transplantasjon Gen terapi (CGD) Stamcelle transplantasjon CD34 H.Sjursen

35 Granulocyttfunksjonsundersøkelser
Kjemotakse Fagocytose (og drap) Oxidative burst (DHR-test) Reseptorundersøkelser Fc-reseptorer (CD16, 32, 64) C-reseptorer (CD11/CD18, CD35) IFNγR1 Toll-like reseptorer (2 og 4) Vi gjør det meste, men ikke alt DHR = dihydrorhodamin FcR-ligand: opsonisert zymosan CR-ligand: komplementopsoniserte bakterier og sopp (S. aureus) IFNγR viktig for forsvaret spesielt mot intracellulære bakterier som mykobakterier og salmonella. IL-12 reseptoren spiller også en rolle her H.Sjursen

36 Kjemotakse H.Sjursen

37 Transwell kjemotaksi plate Granulocytter: porestr. 3 µm
Monocytter: porestr. 5 µm H.Sjursen

38 96 brønners celle cultur plate i polypropylen m rund bunn til flowcytometer
ELISA plate Incubator/ Shaker (Labsystems i EMS) til kjemotaksi, fagocytose, ic. drap H.Sjursen

39 Flowcytometer (Cytomics FC 500 MPL (Multi-plate loader)
Væskestrømscytometri Fagocytose og oxidativ burst S. aureus og opsonisert zymosan Fc- og Komplement reseptormåling H.Sjursen

40 H.Sjursen

41 Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)
H.Sjursen

42 Med to lasere H.Sjursen

43 Med 3 lasere Gir 5 farger Med 3 lasere Med 3 lasere Med 3 lasere
5 Color FACSort optical layout H.Sjursen

44 FCM sorting av 3 ulike alger
H.Sjursen

45 Flow cytometer output of BacLight® stained marine bacteria
Flow cytometer output of BacLight® stained marine bacteria. BacLight® is a dual nucleic acid stain that causes live bacteria to fluoresce green and dead bacteria to fluoresce red when excited with the 488 nm argon laser of the flow cytometer H.Sjursen

46 Ly Celle-debris RBC Granulocytter Mo H.Sjursen

47 gran Mo Ly H.Sjursen

48 Flowcytogram for Oxidativ burst
Samme prinsipp for fagocytose og receptormåling med flere fluoriserende farger H.Sjursen

49 OXIDATIVT BURST – INTRACELLULÆRT DRAP
OX.BURST S.aureus ZYM SERUM: UTEN PHS KTR PAS Granulocytter % Med Fl1 % av KTR 100,0 0,4 62,6 117,5 112,0 116,5 PAS 1 1,8 2,9 7,6 6,5 5,7 5,1 8,7 7,5 H.Sjursen

50 Lett nedsatt fagocytose, uansett serumkilde
Opsoniner i serum viktig: PHS og serum tatt samtidig som cellene fra pasient og frisk kontroll H.Sjursen

51 Reseptor undersøkelser
Merkes med: isoktr-FITC isoktr-PE: Phycoerythrin isoktr-PC5: Phycoeryhrin – Cyanin 5 CD11b-PE: C-receptor III CD18-FITC: CD35-FITC: C-receptor I CD16-PC5: Fc-receptor III CD32-PE: Fc-receptor II CD64-FITC: Fc-receptor I H.Sjursen

52 Leukocytt adhesjonsdefekt (LAD)
LAD1: CD18-defekt, CR3 (komplement reseptor III mangel) LAD2: CD15 selectin-mangel Nøytrofili Defekt adheranse, aggregering, kjemotakse og fagocytose Redusert inflammasjon tross fulminant infeksjon (rtg. thorax neg.) Infeksjoner i hud/mucosa, gingivitt/periodontitt S. aureus og gramnegative stavbakterier Prognose relatert til reseptor nivå H.Sjursen

53 LAD hos pasient, arvet fra mor
Naess et al. Scand J Infect Dis 1999; 31: Første nordiske pasient med LAD CD11, CD18, CD35 nedsatt, dels moderat, svarende til relativt bra prognose CD64 litt høy, kompensatorisk???? * *CD64, FcR I kompensatorisk økning Naess A, Sjursen H, Leegaard J: Leukocyte adhesion deficiency in a Norwegian boy. Scand J Infect Dis; 1999;31(6):600-2 H.Sjursen

54 H.Sjursen

55 Rekvirering av analyser
Undersøkelsene gjøres ved: Infeksjonsmedisinsk forskningslaboratorium, Klinisk Institutt 2, Det medisinsk-odontologiske fakultet, Universitetet i Bergen Forhåndsavtale nødvendig: Kontakt Overingeniør Steinar Sørnes Tlf eller Haakon Sjursen Tlf Takk for oppmerksomheten! H.Sjursen


Laste ned ppt "Granulocyttfunksjons undersøkelser"

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google