Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

Granulocyttfunksjons undersøkelser Haakon Sjursen Universitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus 2013 H.Sjursen1.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "Granulocyttfunksjons undersøkelser Haakon Sjursen Universitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus 2013 H.Sjursen1."— Utskrift av presentasjonen:

1 Granulocyttfunksjons undersøkelser Haakon Sjursen Universitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus 2013 H.Sjursen1

2 Celler i blod Celle typeCeller/mm 3 Funksjon Erythrocytter4.8 – 5.4 x 10 6 Transport av O 2 og CO 2 Granulocytter (ca 1 per 1000 røde) Nøytrofile 70%Fagocytose Basofile1%Histaminproduksjon Eosinofile4%Toksiner mot parasitter Noe Fagocytose Monocytter/ Makrofager 5%Fagocytose Lymfocytter20%B celler: Antistoff produksjon T celler: Cellemediært immunitet Plater Blod koagulasjon H.Sjursen2

3 Den nøytrofile granulocytt Immunforsvarets raskeste Produksjon > 1 x /døgn ca kg per 80 åring Rask turnover: ~ 10 t i blod Evt. 1–2 døgn i vev Endestadiecelle: effektorcelle Cytokinprodusent H.Sjursen3

4 3 linjer i forsvaret mot infeksjon H.Sjursen4 (Innate immune defence)

5 Andre linje forsvar - Fagocytose Fagocytose Gresk: fago = spise og cyto = celle – Fagocytose utføres av nøytrofile og monocytter/makrofager – Nøytrofile dominerer tidlig i infeksjonen – Makrofager er monocytter som forlater blodbanen og utvikles til makrofager som vandrer i vev – Histiocytter er makrofager lokalt i lever, nervesystem, lunger, lymfeknuter, beinmarg o.a. vev H.Sjursen5

6 Marginasjon – «Rolling» langs endotelveggen Adhesjon Migrasjon Diapedese (emigrasjon) Kjemotakse Fagocytose Intracellulært drap NB: kan ha nedsatt funksjon tross normale granulocytter: Ved antistoffmangel eller komplementmangel Den nøytrofile granulocytt H.Sjursen6

7 Marginasjon - Adhesjon - Migrasjon - Diapedese H.Sjursen7

8 8 A neutrophil adheres to the endothelium in a venule (1). It extends its pseudopodium between the endothelial cells and migrates towards the basement membrane (2). After the neutrophil has crossed into the tissue, the endothelium reseals behind (3). The entire process is referred to as diapedesis. (Courtesy of Dr I Jovis)

9 Kjemotakse: Fagocyttene trekkes til Infeksjonsfokus H.Sjursen9

10 Klassisk og alternativ komplement pathways trigger spalting av C3 H.Sjursen10

11 Membran Attack Complex (MAC) forårsaker cytolyse H.Sjursen11

12 H.Sjursen12

13 H.Sjursen13

14 H.Sjursen14

15 Reseptorer og signal interaksjoner ved fagocytose av mikrober (Underhill DM, Ozinsky A, Annu Rev Immunol 2002, 20, 825 H.Sjursen15 Mange reseptorer er involvert. Svikt i én reseptorgruppe kan delvis kompenseres om andre reseptorer er normale

16 Stadier i fagocytose -1 1.Adheranse: Fagocyttens plasmamembran fester seg til bakterien o Hemmes av kapsel (pneumokokker) og M protein (GAS) o Opsonisering: Coating prosess med opsoniner som letter feste o Opsoniner: Antistoff og komplement 2. Internalisering: Plasmamembranen på fagocytten danner pseudopoder som omgir mikroben 3. Mikroben omsluttes av en sekk kalt fagosom 4. Intraacellulært drap: Fagosomet fusjonerer med lysosomet og danner fagolysosomet H.Sjursen16

17 Phagocytose H.Sjursen17

18 Stadier i fagocytose Lysosomale enzymer dreper bakterien innen 10 sec – 20 min. – O 2 uavhengig Lysozym: Ødelegger peptidoglykan i bakteriens cellevegg Lipaser Lactoferrin Proteaser RNAser og DNAser 6. Etter nedbryting dannes residual legemet med ufordøyelig materialer som blir utskilt fra cellen H.Sjursen18

19 Oxidativ burst O 2 - avhengig a) Myeloperoxidase (MPO) b) MPO- uavhengig 1. H 2 O 2 2. Superoxid anion O 2 ¯ 3. Hydroxyl radikal OH ¯ 4. Singlet oxygen O 2 * 5. Ascorbat-peroxid-metall ion 6. Aminosyre oksidasjon 2O 2 + NADPH 2O 2 ¯ + H + + NADP + 2O 2 ¯ + 2H + H 2 O 2 + O 2 H.Sjursen19

20 H.Sjursen20

21 H.Sjursen21 Elektronmikroskopi av en granulocytt som har internalisert Staphylococcus aureus (S)

22 Intracellulær lokalisering av bakterier Fagosom Lysosom Chlamydiae Legionella Mycoplasma Listeria Ingen fusjon med lysosomet Fagolysosom S.aureaus Brucella Salmonella Coxiella burneti pH= Fusjon pH=7.4 B B B B B B Cytoplasma

23 Intracellulær lokalisering av antibiotika Fagolysosom volum 1 to 5% av cellevolumet pH=5.0 Macrolider (x10-50) Aminoglycosider (x2-4) Tetracykliner Fluoroquinoloner Cytoplasma Fagosom pH=7.2 Fluoroquinoloner (x2-8) beta-lactamer (x ) Rifampicin (x2) Aminoglycosides (slow)

24 Intracellulær antibiotika aktivitet Fagolysosom pH 5.0 Macrolider Aminoglycosider Lav eller 0 Cytoplasma PH 7.2 Fagosom pH 7.2 Fluoroquinoloner beta-lactamer * Rifampicin Aminoglycosider Macrolider God Fluoroquinoloner, Doxycyclin God * Husk:Mycoplasma, Chlamydia, Legionella har ikke cellevegg: β-lactamer virker ikke! Chlamydia Legionella Mycoplasma Listeria S aureus Brucella Salmonella Coxiella

25 Fagocyttfunksjons undersøkelser Måles ved Fagocytose laboratoriet ved Institutt for Indremedisin, Universitetet i Bergen Nasjonal referanse laboratorium Hva måles: – Kjemotakse – Fagocytose – Intracellulært drap – Reseptor ekspressjon: Fc-, komplement reseptorer o.a. Hvorfor: Fordi det finnes medfødte og erværvede defekter i alle disse funksjonene H.Sjursen25

26 Kjemotakse defekter Komplement mangel/defekter Inhibitorer (SLE o.a. autoimmune sykdomer Cellulær svikt: Chédiak-Higashi syndrom Immunglobulinmangel (IgA, IgG 1-4) Hyperimmunoglobulinemi E (Job’s syndrom) Hypofosfatemi Opsonindefekter Mannan bindende protein (Lectin) mangel H.Sjursen26 Normalt: →1.8 mm/t Nedsatt ved: Noen infeksjoner Brannskader Malignitet Underernæring Revmatoid arthritt Diabetes mellitus

27 Nøytrofile defekter Defekt i nøytrofil- avhengig immunforsvar Kvantitativ Nøytropeni – den vanligste – Ervervet Medikament indusert Autoimmun Cancer Leukemi – Hereditær Familiær benign (etnisk) nøytropeni Infantil genetisk agranulocytose (Severe congenital neutropenia) Cyklisk nøytropeni H.Sjursen27

28 Kvantitative Granulocyttfunksjons defekter Leukemi, aplastisk anemi, nøytropeni, brannskader, sepsis, diabetes, underernæring, AIDS, nyfødte Hyppigere og alvorligere infeksjoner Ofte med spesielle mikrober Rammer ofte mononukleære fagocytter tilsvarende Funksjonsdefekten fører til lite kliniske funn tross fulminant infeksjon Sjelden sepsis og meningitt H.Sjursen28

29 Kvalitative nøytrofile defekter H.Sjursen29 Adhesjonsdefekter – Leukocytt adhesions mangel (LAD) Type 1 Integrin mangel Type 2 E-selectin ligand mangel

30 Defekter i intracellulært srap Abnormalt respiratory burst Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) Glukose-6-fosfat mangel Granula abnormaliteter – Myeloperoxidase mangel – Spesifikke granula mangler – Chédiak-Higashi syndrom H.Sjursen30

31 H.Sjursen31 Nøytrofil og lymfocytt fra en pasient med Chediak-Higashi syndrom. Store dysmorfe granula (se pil)

32 Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) 1: 250 – (?) 70% x-bundet recessiv Mutasjoner i gener for 4 plasmamembran proteiner Svært nedsatt H 2 O 2 produksjon Excessiv inflammasjon med granulomer DHR-test ( Dihydro-rhodamin for intracellulært drap) H.Sjursen32

33 Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) Alvorlige infeksjoner i hud, øre, lunger, lever, bein –Gingivitt, aphter –Infeksjoner med katalase-produserende mikrober: Staphylococcus aureus Bacillus cepacia Aspergillus Behandling: antibiotika og IFN-γ profylakse H.Sjursen33

34 Behandling av granulocytt defekter Antibiotika profylakse Granulocytt transfusjon (CGD) Beinmargs transplantasjon Gen terapi (CGD) Stamcelle transplantasjon – CD34 H.Sjursen34

35 Granulocyttfunksjonsundersøkelser Kjemotakse Fagocytose (og drap) Oxidative burst (DHR-test) Reseptorundersøkelser Fc-reseptorer (CD16, 32, 64) C-reseptorer (CD11/CD18, CD35) IFNγR1 Toll-like reseptorer (2 og 4) H.Sjursen35

36 Kjemotakse H.Sjursen36

37 H.Sjursen37 Transwell kjemotaksi plate Granulocytter: porestr. 3 µm Monocytter: porestr. 5 µm

38 ELISA plate Incubator/ Shaker (Labsystems i EMS) til kjemotaksi, fagocytose, ic. drap H.Sjursen38 96 brønners celle cultur plate i polypropylen m rund bunn til flowcytometer

39 Flowcytometer (Cytomics FC 500 MPL (Multi-plate loader) H.Sjursen39 Væskestrømscytometri Fagocytose og oxidativ burst S. aureus og opsonisert zymosan Fc- og Komplement reseptormåling

40 H.Sjursen40

41 H.Sjursen41 Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)

42 H.Sjursen42 Med to lasere

43 H.Sjursen43 Med 3 lasere 5 Color FACSort optical layout Med 3 lasere Gir 5 farger

44 H.Sjursen44 FCM sorting av 3 ulike alger

45 H.Sjursen45 Flow cytometer output of BacLight® stained marine bacteria. BacLight® is a dual nucleic acid stain that causes live bacteria to fluoresce green and dead bacteria to fluoresce red when excited with the 488 nm argon laser of the flow cytometer

46 H.Sjursen46 Ly Mo Granulocytter Celle- debris RBC

47 H.Sjursen47 gran Mo Ly

48 Flowcytogram for Oxidativ burst Samme prinsipp for fagocytose og receptormåling med flere fluoriserende farger H.Sjursen48

49 OX.BURSTS.aureus ZYM SERUM:UTENPHS KTR PAS Granulocyt ter%Med Fl1 % av KTR KTR100,00,462,6100,0117,5100,0112,0100,0116,5100,0 PAS 1100,00,41,82,97,66,55,75,18,77,5 OXIDATIVT BURST – INTRACELLULÆRT DRAP H.Sjursen49

50 H.Sjursen50

51 Reseptor undersøkelser Merkes med: – isoktr-FITC – isoktr-PE: Phycoerythrin – isoktr-PC5: Phycoeryhrin – Cyanin 5 CD11b-PE: C-receptor III CD18-FITC: CD35-FITC: C-receptor I CD16-PC5: Fc-receptor III CD32-PE: Fc-receptor II CD64-FITC: Fc-receptor I H.Sjursen51

52 Leukocytt adhesjonsdefekt (LAD) LAD1: CD18-defekt, CR3 (komplement reseptor III mangel) LAD2: CD15 selectin-mangel Nøytrofili Defekt adheranse, aggregering, kjemotakse og fagocytose Redusert inflammasjon tross fulminant infeksjon (rtg. thorax neg.) Infeksjoner i hud/mucosa, gingivitt/periodontitt S. aureus og gramnegative stavbakterier Prognose relatert til reseptor nivå H.Sjursen52

53 LAD hos pasient, arvet fra mor Naess A, Sjursen H, Leegaard J: Leukocyte adhesion deficiency in a Norwegian boy. Scand J Infect Dis; 1999;31(6):600-2 H.Sjursen53 * CD64, FcR I kompensatorisk økning *

54 H.Sjursen54

55 Rekvirering av analyser Undersøkelsene gjøres ved: Infeksjonsmedisinsk forskningslaboratorium, Klinisk Institutt 2, Det medisinsk-odontologiske fakultet, Universitetet i Bergen Forhåndsavtale nødvendig: Kontakt Overingeniør Steinar Sørnes Tlf eller Haakon Sjursen Tlf Takk for oppmerksomheten! H.Sjursen55


Laste ned ppt "Granulocyttfunksjons undersøkelser Haakon Sjursen Universitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus 2013 H.Sjursen1."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google