Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

Tre temaer  1. Protein ekspresjon  Litt generelt om ekspresjon  T7-systemet for ekspresjon i E.coli  cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3)  Rensing.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "Tre temaer  1. Protein ekspresjon  Litt generelt om ekspresjon  T7-systemet for ekspresjon i E.coli  cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3)  Rensing."— Utskrift av presentasjonen:

1 Tre temaer  1. Protein ekspresjon  Litt generelt om ekspresjon  T7-systemet for ekspresjon i E.coli  cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3)  Rensing via ionebytterkromatografi  2. DNA-Bindingsassay: EMSA  Bindingsreaksjon, kompleksdannelse  Elektroforetisk separasjon  3. Radioaktiv merking av oligonukleotid  Oligonukleotid m/ 5´-OH  Polynukleotid kinase (PNK)   -[ 32 P]-ATP

2 Ukens program Amp R E.coli +antibiotika cDNA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA  MANDAG  Kultur med E.coli induseres til protein produkasjon  E.coli høstes, lyseres og ultrasentrifugat preppes  I ventetiden: F Merking av DNA-probe til EMSA F Pakking av kolonne til protein rensing F Støpe PA-geler (SDS-PAGE og EMSA)  TIRSDAG  Rensing av protein på S-Sepharose  SDS-PAGE over natt  EMSA med autoradiogram over natt  ONSDAG  Farge geler, fremkalle film, Vurdere resultat

3 Noen generelle prinsipper Amp R E.coli +antibiotika cDNA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA

4 Ekspresjon og rensing - mange trinn å optimalisere Amp R E.coli +antibiotika cDNA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon Protein rensing

5 Valg av vert for proteinekspresjon  E. coli  Rask vekst, høy produksjon  Fravær av euk.modifikasjoner  Gjær  Rimelig rask vekst  Noen modifikasjoner  Animalske celler i kultur  Langsom, kostbar vekst  Relevante modifikasjoner MengdeModifikasjon Amp R E.coli +antibiotika Plasmid konstruksjon Transformasjon EkspresjonProtein rensing

6 Ekspresjonsvektorer - grunnleggende oppbygning  Plasmider som inneholder elementer som dirigerer ekspresjon av innsatt cDNA  Promoter  Effektiv + Regulerbar  Terminator  MCS - multi cloning site  Seleksjonsmarkør  Ap R - ampicillin resistens markør F Koder for ß-lactamase som gir resistens overfor ampicillin. Ampicillin inhiberer peptidoglycansyntese slik at cellevegg ikke dannes. Ødelegger derfor bare voksende celler.  Cm R - chloramphenicol resistens markør F Kloramfenikol inhiberer protein syntesen. Resistensgenet (CAT) koder for enzymet ”chloramphenicol acetyl transferase” som inaktiverer kloramfenikolet. E.coli ori Amp R Cm R E.coli +antibiotika MCS

7 cDNA innskudd  Det som dirigerer protein syntesen E.coli ori Amp R Cm R E.coli +antibiotika MCS

8 Hva genteknologien har tilført protein biokjemien?  1. Protein ekspresjon forenklet  Kilde: ikke lenger begrenset til naturlige. Når cDNA er tilgjengelig, kan tilhørende protein produseres i store mengder i en rekke verter  Laboppgave: normal kilde = stamceller i benmarg, recombinant kilde = E.coli  2. Enkel generering av mutanter  Punktmutasjoner etter ønske  Studie av subdomener  Tillegg av ”tags” som forenkler påvisning eller rensing

9 Fordeler ved in vitro mutagenese  Punktmutasjoner - mutagenese via PCR  Eks.: Blir serin 116 fosforylert? F Ved mutagenese lages en mutant S116A (ikke fosforylerbar uten OH-gruppe) som testes. Hvis villtypen men ikke mutanten fosforyleres, kan spørsmålet besvares positivt.  Ekspresjon av subdomener  Jfr PCR-forelesning  Laboppgave: R2R3 svarende til aa i c-Myb  Påsetting av ”tags” som letter rensing  Tags er små tilleggssekvenser som gir proteinet evne til å bindes spesifikt til visse kolonner  His 6 -tags gir binding til immobilisert Ni 2+ -kolonner  GST-tags gir binding til glutathion kolonner  Epitoper (HA, FLAG) binder immobilisert antistoff Protein X Protein Y Protein Z

10 Fordelen med tags - rensing og påvisning Amp R E.coli +antibiotika cDNA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon Protein rensing i et trinn Via tag-binding til kolonne * * * * Immunfarging via tag

11 Ekspresjon og rensing - mange trinn å optimalisere Amp R E.coli +antibiotika cDNA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon Protein rensing Signal for translasjon RBS - AGGAGG 9±3 foran AUG AUG - AUG > GUG,UUG,AUU,AUA Stop kodon - UAA best Kodon-bruk Flere kodon-muligheter pr aa Human pref ≠ E.coli, kan hemme translasjon

12 c-Myb proteinet Amp R E.coli +antibiotika cDNA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA

13 Amp R E.coli +antibiotika cDNA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA

14 T7 systemet Amp R E.coli +antibiotika cDNA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA

15 T7 systemet

16 T7 systemet for ekspresjon  Kaskade effekt  Et gen, mange transkript  Et transkript, mange translaterte protein  Høyt nivå av mRNA for cDNA  LysS koder for lysozym med to funksjoner  Inhibitor av T7 RNA polymerase (holder basalnivå nede)  Letter lysis ved å fordøye cellevegg

17 Praktiske sider ved laboppgaven Amp R E.coli +antibiotika cDNA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA

18 Dyrking og induksjon Celle- tetthet Induksjon +IPTG Høsting Renhet: SDS-PAGE DNA-bindende aktivitet: EMSA Syntese av protein

19 Protein ekspresjon - ekstraksjon fra celler +antibiotika  Mekanisk  Sonikering (ultralyd)  Presser  Enzymatisk  Celleveggfordøying  Kjemisk  detergenter

20 Lysis av E.coli  Triton X-100: permeabilisering av plasmamembranen  Lysozym lekker ut og angriper celleveggen  Lysat dannes  Ultrasentrifugering gir ”cellefritt ekstrakt” Myb lysozym Peptidoglycan cellevegg Plasmamembran Cellefritt ekstrakt

21 Løselighet av rekombinant protein  To konkurrerende prosesser:  Folding til løselig protein  Aggregering til uløselig protein (”inclusion bodies”)  Temperatur-avhengig balanse  Hvis mye er uløselig, kan utbyttet av løselig protein forbedres ved å senke dyrkingstemperatur  Test av løselighet  Uttak fra kultur - cellepellet kokt i SDS = totalt protein  Lysat - ultrasentrifugering - supernatant = løselig protein Syntese Folding Løselig Aggregering Uløselig Løselig Uløselig Løselig Uløselig 37 o C 25 o C

22 Protein rensing - laboppgave: ionebytter Protein rensing +antibiotika  Separasjon av proteiner på grunnlag av ulike antall ladninger tilgjengelig for interaksjon med kolonnematerialet  pH bestemmer ladning på kolonne og protein  Ionestyrke bestemmer likevekt/affinitet, varieres ved gradient-eluering

23 Kromatogram A 280 Salt- gradient Proteiner som Ikke binder ionebytter Indusert c-Myb protein Renhet: SDS-PAGE DNA-bindende aktivitet: EMSA

24 Analyse ved SDS-PAGE -IPTG +IPTG ultra Toppfraksjoner Induksjon OK - størrelse - intensitet Indusert prot = løselig Effektiv rensing

25 Tre temaer: protein ekspresjon  1. Protein ekspresjon  T7-systemet for ekspresjon i E.coli  cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3)  Rensing via ionebytterkromatografi  2. DNA-Bindingsassay: EMSA  Bindingsreaksjon, kompleksdannelse  Elektroforetisk separasjon  3. Radioaktiv merking av oligonukleotid  Oligonukleotid m/ 5´-OH  Polynukleotid kinase (PNK)   -[ 32 P]-ATP

26 EMSA: electrophoretic mobility shift assay  Grunnprinsipp: Kompleks av protein+DNA har redusert mobilitet i nativ PA-gel relativt til DNA-probe  Mobilitet bestemmes av  Størrelse - proteinbinding øker størrelsen  Ladning - probens ladning reduseres ved binding av basisk protein  Form - kan påvise konformasjonsendring i DNA  DNA-probe  Duplex på bp radioaktivt merket  Spesifikk sekvens gjenkjent av protein  Samme assay til en rekke ulike DNA- bindende protein ved å bytte sekvens - prot +prot

27 EMSA: enkel assay med mange bruksområder  Enkelt assay-system for DNA-binding  Følge rensing  Påvise spesifikk DNA-bindende faktor i celleekstrakt  Analytisk bruk  Teste mutanter i protein eller DNA  Bestemmelse av bindingskonstanter  Bestemmelse av kinetiske konstanter  Kan påvise indusert konformasjonsendring i DNA  Syntetisk bruk  Preparativ isolering av ukjent faktor - prot +prot

28 EMSA: trinn i praktisk oppsett  Lage DNA-probe radioaktivt merket  Støpe PA-gel  Ikke-denaturerende gel  Bindingsreaksjon  Optimale betingelse for kompleksdannelse  Elektroforese  Autoradiografi - prot +prot

29 Tre temaer: protein ekspresjon  1. Protein ekspresjon  T7-systemet for ekspresjon i E.coli  cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3)  Rensing via ionebytterkromatografi  2. DNA-Bindingsassay: EMSA  Bindingsreaksjon, kompleksdannelse  Elektroforetisk separasjon  3. Radioaktiv merking av oligonukleotid  Oligonukleotid m/ 5´-OH  Polynukleotid kinase (PNK)   -[ 32 P]-ATP

30 Merking av oligo i 5´-ende O-P-O-P-O-P OHOH OHOH OHOH O-O- O-O- O-O- ATP PNK polynukleotid kinase

31 EMSA: tester for spesifisitet  Konkurranse (competition)  Utkonkurrering med overskudd av spesifikk versus uspesifikk oligo  Med kompleks med kjerneekstrakt: ulike komplekser identifiseres utfra hva de utkonkurreres med  Supershift  Tilsetting av antistoff mot DNA-bindende protein påvirker komplekset på en av to måter  1. Komplekset binder Ab og migrerer langsommere (=supershift)  2. Kompleksdannelse inhiberes fordi Ab blokkerer DNA- bindende domene: bortfall av kompleks Ref +spes +uspes Ref +Ab +IgG

32 EMSA: konkurranse-test for spesifisitet Ref +spes +uspes Spesifikk oligo Uspesifikk oligo

33 EMSA: spesifisitetstest viktig ved analyse av ekstrakter  EMSA i komplekse blandinger  EMSA kan brukes til å påvise tilstedeværelse av ulike DNA-bindende faktorer i celleekstrakter  Vanlig med komplekst mønster av kompleksbånd - hvilke tilhører hvilken faktor?  Utkonkurrering med overskudd av spesifikk oligo benyttes til å identifisere ulike komplekser  Supershift  Alternativ analyse med antistoff mot DNA-bindende protein: kan gi supershift eller bortfall av kompleks Ref +stimuli Faktor X? Faktor Y? Ref +X-oligo +Y-oligo Ref +anti-X +anti-Y

34 EMSA: 2 labforsøk  Assay for tilstedeværelse av c-Myb  Konklusjon: c-Myb aktivitet tilstede i cellefritt ekstrakt og i toppfraksjon  Konkurranse (competition)  Utkonkurrering med overskudd av spesifikk versus uspesifikk oligo  Konklusjon: indusert c-Myb R2R3 protein binder oligonukleotidet spesifikt Ref +spes +uspes Råex Fraksjoner

35 Radioisotoper brukt i biokjemisk arbeid  Av ulike isotoper er noen ustabile radioisotoper som avgir stråling  To typer aktuelle i biokjemisk arbeid:  - og  -stråling   - stråling:  Neutron proton + +  - + antineutrino  Atomnr øker +1 (C N, P S)   - partikler lette å detektere  Random prosess - energispektrum   stråling: tunge radioisotoper ( 125 I)  Multistep decay som gir høyenergi-fotoner 12 C 13 C 14 C 14 N ß - partikkel stabile

36 Radioaktivitet - enheter og måling  Radioaktiv stråling måles i Ci eller Bq  Ci (Curie) = desintegrasjoner fra 1 g radium = 2.2 x10 12 dpm F Praktisk omregning: 1 µCi = 2.22 x 10 6 dpm  SI enhet = Becquerel (Bq) = 1 dps F Praktisk omregning: 1 µCi = 3.7 x 10 4 Bq  Måling skjer i scintillasjonsteller   - stråling scintillasjonstelling i løsning hvor stråling omdannes til lys F Løsningen (”tellevæske”) inneholder fluoroforer F For 32 P kan man bruke vann (Cerenkov telling) Max 40% effektivitet   stråling scintillasjonstelling i fast fase hvor stråling omdannes til lys  Tellereffektivitet = cpm/dpm x 100%

37 Radioaktivitet - regler for sikkerhet  Unngå å få isotoper innabords  Munnpipettering forbudt, avtrekk hvis flyktige forbindelser  Unngå hudkontakt  Bruk alltid hansker  Bruk skjermbeskyttelse mot høyenergi-stråling  Vær nøye med å unngå ”søl”  Bruk isotop-lab ved høye doser, sjekk alltid benk med monitor etter bruk, vask utstyr grundig etter bruk og sjekk med monitor  Kast alt kontaminert avfall (løsninger og plast) i dertil egnede kontainere  Ved jevnlig bruk, benytt dosimeter


Laste ned ppt "Tre temaer  1. Protein ekspresjon  Litt generelt om ekspresjon  T7-systemet for ekspresjon i E.coli  cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3)  Rensing."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google