Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

KJB220 1 PCR - polymerase chain reaction Prinsipp og metode.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "KJB220 1 PCR - polymerase chain reaction Prinsipp og metode."— Utskrift av presentasjonen:

1 KJB220 1 PCR - polymerase chain reaction Prinsipp og metode

2 KJB220 2 PCR - prinsipp PCR er primer-mediert enzymatisk amplifisering av spesifikke DNA-sekvenser (genomisk eller klonet) ca. 10 år gammel metode som har revolusjonert molekylærbiologien ( og gitt Nobelpris til Kary Mullis ) Syklisk prosess av tre trinn –denaturering av dsDNA templat –annealing av to motsatt rettede primere til ssDNA templat –elongering av ny komplementær DNA v.hj.a. varmestabil DNA polymerase Akkumulering av dsDNA med eksponesiell hastighet –Hver syklus skulle i teorien doble mengden DNA –I praksis er effektiviteten av hver syklus <1 slik at Y = X (1 + eff.) n –Amplifisering når et platå etter 10 5 til 10 9 fold økning

3 KJB220 3 PCR - prinsipp 94 o C 72 o C 55 o C Annealing Elongering Denaturering Tid Temp. Tid En syklus

4 KJB220 4

5 5 Dobling trinn for trinn

6 KJB220 6 Eksponensiell amplifikasjon

7 KJB220 7 Eksponensiell økning Amplification curve PCR-basis: N 0 x 2 n N = N 0 x 2 n –N: antall amplifiserte molekyler –N 0 : opprinnelig antall molekyler –n: antall sykler

8 KJB220 8 Bruk Analytisk –Påvise nærvær av en spesifikk sekvens i et biologisk materiale Spesifisitet bestemt av primere, forventet størrelse, eventuelt hybridisiering –Medisin - diagnostikk (f.eks påvise mutasjoner knyttet til sykdom), –Mikrobiologi - påvise mikroorganisme, –Rettsmedisin - biologiske spor, –Arkeologi osv. Syntetisk –Verktøy for å modifisere DNA –Innen forskning: Lett å legge til startkodon, stoppkodon, restriksjonsseter, mutagenese

9 KJB220 9 PCR enzymer Varmestabil DNA polymerase –dNTP  DNA templatavh. primeravh. Vanlig brukte –Taq DNA pol. –Vent DNA pol. –Pfu DNA pol. 5´-3´-Exonuclease –Degraderer nedstrøms primer - lineære templater optimalt 3´-5´-Exonuclease –Proofreading - korrigerer feilinkorporeringer –Taq uten proofreading, Vent og Pfu med proofreading

10 KJB Primere Typisk lengde nukleotider – % GC Tm bestemmes av sekvens og reaksjonsbetingelser –Tm = temp hvor 50% av primer har hybridisert (dsDNA) og 50% er fri (ssDNA) –Kan grovt estimeres som Tm = 2x [#AT-bp] + 4x [#GC-bp] –Kan mer presis estimeres av dataprogrammer –Salt stabiliserer: Tm avtar med fallende ionestyrke Optimal annealingstemp = Tm - 5˚C –normalt mellom 55 og 72 ˚C Balansert Tm for de to primere Konsentrasjon: µM –For høy kons fremmer misinkorporering, falsk priming og primer-dimer dannelse

11 KJB Primere - kriterier for design Annealing av primer til templat kritisk trinn i prosessen –optimalt: bare annealing til spesifikke områder –i praksis: også falsk priming til uspesifikke områder Unngå komplementære 3´-ender - fremmer primer- dimer – bp produkt –forbruker primere og enzym, reduserer utbytte Unngå G-serier og C-serier (> 3nt) i 3´-enden –fremmer falsk priming i GC-rike områder Unngå interne palindromer

12 KJB Primernes 5´-ende: sted for tillegg 5´-ende av primerne trenger ikke være komplementære med templat DNA Blir presist inkorporert i sluttprodukt Egnet til å legge til restriksjonskuttesteder, promotersekvenser, ATG-translasjonsstart, stop kodons osv. Restriksjonskuttested ATG Restriksjonskuttested Stopkodons ATG Stopp PCR Gen

13 KJB DNA templat Renhet ikke kritisk –En av fordelene med PCR er nettopp at spesifikke DNA-molekyler i en kompleks blanding kan amplifiseres (nåla i høystakken identifiseres ved å amplifisere nåla) –Basis for bruk av PCR i kriminalsaker –Kurset: amplifisere direkte fra en bakteriekoloni –Forurensinger kan inhibere DNA polymerasen Mengde –1 molekyl nok – molekyler anbefales –nanogram mengder av klonet DNA –mikrogram mengder av genomisk DNA Også RNA kan brukes –omdannes til ssDNA templat via revers transkriptase

14 KJB PCR-maskiner og rør Maskiner: programmerbar varmeblokk “Hold-time” må være tilstrekkelig til temp.likevekt PCR-rør: tykkelsen av plastveggen bestemmer tid for temp.likevekt –polypropylen tynnveggede optimalt –Ned til 15 sek ekvilibreringstid Problem med fordampning: –Oljedekke over –Varme i lokk hindrer kondensasjon og væsketransport Olje PCR-mix Varme i lokk hindrer kondens PCR-mix

15 KJB Valg av PCR-syklus Denaturering temp. og tid –94 ˚C i 5 min., 95 ˚C i 30 sek., 97 ˚C i 15 sek. –For høy: enzymet inaktiveres –For lav: snapback av templat Annealingstemp. og tid –Temp. justeres for hvert sett av primere –Tid: 30 sek nok Elongeringstemp. 72 ˚C Elongeringstid – nt pr sek –Justeres for hver reaksjon utfra regel om at man pr minutt kan lage 1- 2 kb DNA –Kan økes utover i programmet når enzym/templat ratio avtar Antall sykler –Med størrelsesorden 10 5 templatmolekyler brukes sykler –Bruk ikke flere enn nødvendig (bakgrunn øker) 94 o C 72 o C 55 o C Annealing Elongering Denaturering Tid Temp. Tid

16 KJB Optimalisering av reaksjonsbetingelser Mg ++ konsentrasjon –DNA pol. krever fri Mg ++ –[Mg ++ ] påvirker flere trinn (annealing, polymerase osv) –Flere komponenter i blandingen (særlig dNTP) binder Mg ++. Viktig at det er tilstrekkelig overskudd av fri [Mg ++ ]. –Ved optimalisering: varier [Mg ++ ] i trinn på 0.5 mM dNTP ( ekvimolar blanding av dGTP, dATP, dCTP, dTTP ) –Optimalt mellom 20 og 200 µM 20 µM i 100 µl nok til 2.6 µg DNA (400 bp) –Lav konsentrasjon best mhp spesifisitet og fidelitet –Stabilitet: 50% igjen etter 50 cycler

17 KJB Optimalisering av reaksjonsbetingelser forts Buffer og salt – mM TrisHCl som buffer –pH 8.3 justert ved RT (husk temp avh.: gjennom sykler ) –Opptil 50 mM KCl for å fremme primer annealing (for høy salt hemmer enzym) Enzymmengde –Taq DNA pol.: enheter –Ved optimalisering: varier fra enheter pr. 100 µl –For mye enzym: uspesifikke produkt –For lite enzym: lavt utbytte Andre tilsetninger –BSA for å stabilisere enzymet –Ikke-ioniske detergenter (Tween 20) også for å stabilisere enzymet –DMSO eller glycerol kan ha fordelaktig effekt på vanskelige templater

18 KJB Analyse av PCR-produkt Agarosegel elektroforese Forventet Størrelse - et bånd Mange ekstra bånd Bånd av feil størrelse Troubleshooting?

19 KJB Troubleshooting Problem: ingen produkt –TILTAK: Optimalisering av reaksjonsbetingelser (titrere enzym, Mg..) Optimalisering av temperaturer / tider i PCR programmet Problem: falske produkt –TILTAK : Høyere annealingstemp. Hot start “Strupende” betingelser: mindre enzym, mindre dNTP, færre sykler Renslighet (“carryover” problematikk) Problem: primer-dimer –TILTAK : som over + design Problem: PCR-genererte mutasjoner –TILTAK : Proofreading enzym Blanding av proofreading enzym og Taq Senke dNTP konsentrasjon

20 KJB Stringens Hot start –Tilsetning av enzym etter oppvarming hindrer elongering av falsk priming Voks –holder komponenter adskilt inntil temp blir så høy at voksen smelter Inaktivt enzym (AmpliTaq Gold) –reaktiveres etter inkubering ved ˚C i 9-12 min Mix av enzymer –Taq + proofreading varmestabil polymerase –Den siste korrigerer feilinkorporering som stopper elongering

21 KJB RT-PCR Mye brukt anvendelse av PCR –for å detektere og kvantitere eukaryote RNA species isolert fra ulike vev eller cellulære kilder. To trinn –1. Første-tråd cDNA syntese med revers transkriptase, dNTP og primer –2. PCR Primer til første-tråd cDNA syntese –pd(N)6 Primer (random hexamers) –Not I-(dT)18 RT PCR

22 KJB Real-time PCR: PCR til kvantitering av RNA/DNA RNA isolering cDNA-syntese PCR med fluorescense deteksjon –Analyse med real-time PCR på et instrument som har on-line deteksjon av fluorescence

23 KJB Deteksjon av PCR-produkt mens de dannes via fluorescense Alternativ I: SYBR-green måling av akkumulert total DNA Alternativ II: Hybridiserings-prober måling av akkumulert spesifikk DNA

24 KJB Real-time PCR: prinsipp for kvantitering Med en serie av kjente mengder input, lages en standardkurve som ukjente prøver kan kvantiteres utfra. linear Log N 0 n Standard curve Formula for compared reactions Noiseband = log N 0 + n log2 Starting amount (known or estimated) # cycles at cross-point (measured) Instrumentet genererer en lineær standard kurve som gir sammenhengen mellom utgangsmengder templat og antall PCR-sykler Mye templat Mindre templat


Laste ned ppt "KJB220 1 PCR - polymerase chain reaction Prinsipp og metode."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google