Laste ned presentasjonen
Presentasjon lastes. Vennligst vent
1
Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner
Elektroforese Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner
3
Begreper Elektroforese; separasjon av ladede løste komponenter/partikler i en løsning under påvirkning av et elektrisk felt Iontoforese (små molekyler / ioner) Sone-elektroforese (protein, DNA) Elektroferogram (densitometri) Amfolytt
5
Amfolytt - +
6
Vandring i et elektrisk felt
Molekylets netto ladningen er avhengig av pH (amfolytter) Vandringshastigheten er proporsjonal med netto ladning, og omvendt proporsjonal med størrelse og viskositet Q μ = · π · r · η
7
Skjematisk elektroforese-oppsett
Elektrisk feltstyrke Molekylets beskaffenhet Bufferen Støttemedium Temperatur og fordamping
8
Det elektriske feltet Ohms lov: U = R · I Effekt: E = U · I
Elektrisk feltstyrke: F = U / L [Volt/cm] Varmeutvikling: U · I · t Konstant spenning / strømstyrke / effekt / pulsed-field
9
Bufferen Bufferionene ”bærer” strømmen
pH; bestemmer molekylenes total-ladning Ionestyrke og konsentrasjon; bestemmer migrasjonsrate og oppløsning Valens og ionestørrelse Viskositet
10
Jo høyere ionestyrker, desto større ionesky =>
lavere migrasjonshastighet og høyere oppløsning, men større varmeutvikling.
11
Påsetting av prøve på gel
Submarin applisering ”Loading”-buffer Applisering på gel
12
Støttemedium; ønskede egenskaper:
Ikke påvirke mobiliteten til buffer-ionene Stabilisere stor væskemengde i mediet Ikke være løselig i bufferen Inert for prøvemolekylene Porestørrelse tilpasset ønsket separasjon Homogen struktur Lavt egenpotensiale; elektroosmotisk flow
14
Elektroosmotisk flow / Elektroendosmose
Buffer Protein Katode Anode - - - + - - - - - Overflate på en geltråd
15
Separasjonsbetingelse
Molekylets ladning / masse ratio Molekylstørrelse vs. porestørrelse Gelmaterialer Agarose Polyakrylamid PAGE (Stivelse, celluloseacetat, papir)
16
Agarose Store porer ved 0,5 – 1 % agarose Ladning/masse-ratio Klar
Lite elektroendosmose Egnet for proteiner og for DNA-fragment (< 20 kbp)
17
Polyakrylamid Kjemisk inert Nærmest ingen elektroendosmose Klar
Termostabil Porestørrelse etter behov Ladning/masse-ratio og molekylstørrelse Egnet for små DNA-fragment (<1 kbp) og denaturert protein (SDS-PAGE) NB! Monomeren er svært giftig
18
«Native» elektroforese
Elektroforese under denaturerende betingelser
19
Temperatur og fordamping
20
Liggende vs. stående gel
22
Visualisering ved gelelektroforese
Fiksering Farging Avfarging Momenter å ta hensyn til: Diffusjon i gelen Spesifikk farge for det en ønsker visualisert Bakgrunnsfarge minst mulig Farges alle typer proteiner likt? Fargeopptak / fargeintensitet Egnethet for densitometri / deteksjon
23
Serumprotein-elektroforese
Elektroforogram Agarose-gel
24
Spinalvæske- og serum-
elektroforese Høyere oppløsning Mer sensitiv farge
25
Hemoglobin-elektroforese Ulik vandring ved forskjellig pH
Ulike fargevalg pH 8,6 pH 4,5
26
Lipoprotein-elektroforese i serum
Lipid-farge benyttet HDL VLDL LDL Chylomikroner
27
Elektroforetisk separasjon av DNA-fragmenter Farget med etidiumbromid
Fluorescens fotografert Stige
28
Isoelektrisk fokusering Separasjon på ulik pI
29
Todimensjonal elektroforese (2D-elfo)
31
Kapillærelektroforese
34
- Kapillærelektroforese; + Kapillæret fylt med buffer;
Separerer på ladning Katode - Anode +
35
- Kapillær gelelektroforese + Kapillæret fylt med polymer
Separerer på størrelse Katode - Anode +
37
”Blotte”-teknikker Western blotting (protein + antistoff)
Southern blotting (DNA + DNA-probe) Northern blotting (RNA + RNA-probe) 1. Elektroforese 2. Blotting 3. Spesifikk merking 4. Visualisering
38
Elektroforese
39
Blotting
41
Spesifikk merking og visualisering
42
Eksempel: Western blotting av celle- og tumorlysater, antistoffer mot
fosforylert-Akt (rød) og total-Akt (grønn) fremkalt i NIR-skanner. 125 kD 100 83 59 44 37 25 20 15 7,5 Stige Αkt/p-Akt (60 kD)
Liknende presentasjoner
© 2024 SlidePlayer.no Inc.
All rights reserved.