Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner"— Utskrift av presentasjonen:

1 Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner
Elektroforese Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner

2

3 Begreper Elektroforese; separasjon av ladede løste komponenter/partikler i en løsning under påvirkning av et elektrisk felt Iontoforese (små molekyler / ioner) Sone-elektroforese (protein, DNA) Elektroferogram (densitometri) Amfolytt

4

5 Amfolytt - +

6 Vandring i et elektrisk felt
Molekylets netto ladningen er avhengig av pH (amfolytter) Vandringshastigheten er proporsjonal med netto ladning, og omvendt proporsjonal med størrelse og viskositet Q μ = · π · r · η

7 Skjematisk elektroforese-oppsett
Elektrisk feltstyrke Molekylets beskaffenhet Bufferen Støttemedium Temperatur og fordamping

8 Det elektriske feltet Ohms lov: U = R · I Effekt: E = U · I
Elektrisk feltstyrke: F = U / L [Volt/cm] Varmeutvikling: U · I · t Konstant spenning / strømstyrke / effekt / pulsed-field

9 Bufferen Bufferionene ”bærer” strømmen
pH; bestemmer molekylenes total-ladning Ionestyrke og konsentrasjon; bestemmer migrasjonsrate og oppløsning Valens og ionestørrelse Viskositet

10 Jo høyere ionestyrker, desto større ionesky =>
lavere migrasjonshastighet og høyere oppløsning, men større varmeutvikling.

11 Påsetting av prøve på gel
Submarin applisering ”Loading”-buffer Applisering på gel

12 Støttemedium; ønskede egenskaper:
Ikke påvirke mobiliteten til buffer-ionene Stabilisere stor væskemengde i mediet Ikke være løselig i bufferen Inert for prøvemolekylene Porestørrelse tilpasset ønsket separasjon Homogen struktur Lavt egenpotensiale; elektroosmotisk flow

13

14 Elektroosmotisk flow / Elektroendosmose
Buffer Protein Katode Anode - - - + - - - - - Overflate på en geltråd

15 Separasjonsbetingelse
Molekylets ladning / masse ratio Molekylstørrelse vs. porestørrelse Gelmaterialer Agarose Polyakrylamid PAGE (Stivelse, celluloseacetat, papir)

16 Agarose Store porer ved 0,5 – 1 % agarose Ladning/masse-ratio Klar
Lite elektroendosmose Egnet for proteiner og for DNA-fragment (< 20 kbp)

17 Polyakrylamid Kjemisk inert Nærmest ingen elektroendosmose Klar
Termostabil Porestørrelse etter behov Ladning/masse-ratio og molekylstørrelse Egnet for små DNA-fragment (<1 kbp) og denaturert protein (SDS-PAGE) NB! Monomeren er svært giftig

18 «Native» elektroforese
Elektroforese under denaturerende betingelser

19 Temperatur og fordamping

20 Liggende vs. stående gel

21

22 Visualisering ved gelelektroforese
Fiksering Farging Avfarging Momenter å ta hensyn til: Diffusjon i gelen Spesifikk farge for det en ønsker visualisert Bakgrunnsfarge minst mulig Farges alle typer proteiner likt? Fargeopptak / fargeintensitet Egnethet for densitometri / deteksjon

23 Serumprotein-elektroforese
Elektroforogram Agarose-gel

24 Spinalvæske- og serum-
elektroforese Høyere oppløsning Mer sensitiv farge

25 Hemoglobin-elektroforese Ulik vandring ved forskjellig pH
Ulike fargevalg pH 8,6 pH 4,5

26 Lipoprotein-elektroforese i serum
Lipid-farge benyttet HDL VLDL LDL Chylomikroner

27 Elektroforetisk separasjon av DNA-fragmenter Farget med etidiumbromid
Fluorescens fotografert Stige

28 Isoelektrisk fokusering Separasjon på ulik pI

29 Todimensjonal elektroforese (2D-elfo)

30

31 Kapillærelektroforese

32

33

34 - Kapillærelektroforese; + Kapillæret fylt med buffer;
Separerer på ladning Katode - Anode +

35 - Kapillær gelelektroforese + Kapillæret fylt med polymer
Separerer på størrelse Katode - Anode +

36

37 ”Blotte”-teknikker Western blotting (protein + antistoff)
Southern blotting (DNA + DNA-probe) Northern blotting (RNA + RNA-probe) 1. Elektroforese 2. Blotting 3. Spesifikk merking 4. Visualisering

38 Elektroforese

39 Blotting

40

41 Spesifikk merking og visualisering

42 Eksempel: Western blotting av celle- og tumorlysater, antistoffer mot
fosforylert-Akt (rød) og total-Akt (grønn) fremkalt i NIR-skanner. 125 kD 100 83 59 44 37 25 20 15 7,5 Stige Αkt/p-Akt (60 kD)


Laste ned ppt "Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner"

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google