Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

Elektroforese Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "Elektroforese Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner."— Utskrift av presentasjonen:

1 Elektroforese Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner

2

3 Begreper  Elektroforese; separasjon av ladede løste komponenter/partikler i en løsning under påvirkning av et elektrisk felt  Iontoforese (små molekyler / ioner)  Sone-elektroforese (protein, DNA)  Elektroferogram (densitometri)  Amfolytt

4

5 Amfolytt + -

6  Molekylets netto ladningen er avhengig av pH (amfolytter)  Vandringshastigheten er proporsjonal med netto ladning, og omvendt proporsjonal med størrelse og viskositet Q μ = 6 · π · r · η Vandring i et elektrisk felt

7 Skjematisk elektroforese-oppsett  Elektrisk feltstyrke  Molekylets beskaffenhet  Bufferen  Støttemedium  Temperatur og fordamping

8 Det elektriske feltet  Ohms lov: U = R · I  Effekt: E = U · I  Elektrisk feltstyrke: F = U / L [Volt/cm]  Varmeutvikling: U · I · t  Konstant spenning / strømstyrke / effekt / pulsed-field

9 Bufferen  Bufferionene ”bærer” strømmen  pH; bestemmer molekylenes total- ladning  Ionestyrke og konsentrasjon; bestemmer migrasjonsrate og oppløsning  Valens og ionestørrelse  Viskositet

10 •Jo høyere ionestyrker, desto større ionesky => lavere migrasjonshastighet og høyere oppløsning, men større varmeutvikling.

11 Påsetting av prøve på gel Applisering på gel Submarin applisering ”Loading”-buffer

12 Støttemedium; ønskede egenskaper:  Ikke påvirke mobiliteten til buffer-ionene  Stabilisere stor væskemengde i mediet  Ikke være løselig i bufferen  Inert for prøvemolekylene  Porestørrelse tilpasset ønsket separasjon  Homogen struktur  Lavt egenpotensiale; elektroosmotisk flow

13

14 Elektroosmotisk flow / Elektroendosmose Overflate på en geltråd Buffer Protein Anode Katode -

15 Separasjonsbetingelse  Molekylets ladning / masse ratio  Molekylstørrelse vs. porestørrelse Gelmaterialer  Agarose  Polyakrylamid PAGE  (Stivelse, celluloseacetat, papir)

16 Agarose  Store porer ved 0,5 – 1 % agarose  Ladning/masse-ratio  Klar  Lite elektroendosmose  Egnet for proteiner og for DNA- fragment (< 20 kbp)

17 Polyakrylamid  Kjemisk inert  Nærmest ingen elektroendosmose  Klar  Termostabil  Porestørrelse etter behov  Ladning/masse-ratio og molekylstørrelse  Egnet for små DNA-fragment (<1 kbp) og denaturert protein (SDS-PAGE)  NB! Monomeren er svært giftig

18  «Native» elektroforese  Elektroforese under denaturerende betingelser

19 Temperatur og fordamping

20 Liggende vs. stående gel

21

22 Visualisering ved gelelektroforese  Fiksering  Farging  Avfarging  Momenter å ta hensyn til:  Diffusjon i gelen  Spesifikk farge for det en ønsker visualisert  Bakgrunnsfarge minst mulig  Farges alle typer proteiner likt?  Fargeopptak / fargeintensitet  Egnethet for densitometri / deteksjon

23 Serumprotein-elektroforese Agarose-gel Elektroforogram

24 Spinalvæske- og serum- elektroforese Høyere oppløsning Mer sensitiv farge

25 Hemoglobin-elektroforese Ulik vandring ved forskjellig pH Ulike fargevalg pH 8,6 pH 4,5

26 Lipoprotein-elektroforese i serum Lipid-farge benyttet HDL VLDL LDL Chylomikroner

27 Elektroforetisk separasjon av DNA-fragmenter Farget med etidiumbromid Fluorescens fotografert Stige

28 Isoelektrisk fokusering Separasjon på ulik pI

29 Todimensjonal elektroforese (2D-elfo)

30

31 Kapillærelektroforese

32

33

34 Kapillærelektroforese; Kapillæret fylt med buffer; Separerer på ladning Katode - Anode +

35 Kapillær gelelektroforese Kapillæret fylt med polymer Separerer på størrelse Anode + Katode -

36

37 ”Blotte”-teknikker  Western blotting (protein + antistoff)  Southern blotting (DNA + DNA-probe)  Northern blotting (RNA + RNA-probe)  1. Elektroforese  2. Blotting  3. Spesifikk merking  4. Visualisering

38 Elektroforese

39 Blotting

40

41 Spesifikk merking og visualisering

42 125 kD ,5 Αkt/p-Akt (60 kD) Stige Eksempel: Western blotting av celle- og tumorlysater, antistoffer mot fosforylert-Akt (rød) og total-Akt (grønn) fremkalt i NIR-skanner.


Laste ned ppt "Elektroforese Biokjemisk separasjonsmetode med mange applikasjoner."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google