Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet

Presentasjon om: "Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet"— Utskrift av presentasjonen:

1 Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet
Gjennom genetisk og molekylær analyse

2 Oversikt over kap.10 Utfordringer og strategier ved genomanalyse
Genomstørrelse Egenskaper må også analyseres Problemer med DNA polymorfismer Utvikling av hel-genom kart Innsikt kommer fra fullstendig genomsekvensering Antall og type gener Grad av repeterte sekvenser Genom organisering og struktur Evolusjon og lateral genoverføring Høyeffektive verktøy for å analysere genomer og deres proteinprodukter DNA sekvensatorer DNA arrays (mikromatriser) Massespektrofotometere

3 Genomene til levende organismer varierer enormt i størrelse

4 Genomikere ser på to hovedtrekk ved genomer: sekvens og polymorfisme
Hovedutfordring å bestemme sekvensen til hvert kromosom i genomet og identifisere mange polymorfismer Hvordan kan man sekvensere et 500 Mb kromosom med 600 bp på en gang? Hvor nøyaktig skal en genomsekvens være? DNA sekvenseringsfeil er på omkring 1% per 600 bp Hvordan kan en skille sekvensfeil fra polymorfismer? Forekomst av polymorfismer i diploide humane genomer er omkring 1 av 500 bp Gjentatte sekvenser kan være vanskelige å plassere Uklonbart DNA kan ikke sekvenseres Opp til 30% av genomet er heterokromatisk DNA som ikke kan klones

5 Splitt og overvinn strategien imøtekommer de fleste utfordringer
Kromosomer blir brutt ned i små overlappende biter og klonet Endene til klonene blir sekvensert og satt sammen til de opprinnelige kromosomtrådene Hvert stykke blir sekvensert mange ganger for å redusere feilmarginen 10-gangers sekvensdekning gir en feilmargin på mindre enn1/10 000

6 Figure 10.2 Fig. 10.2

7 Teknikker for kartlegging og kloning
Bibliotek med DNA fragmenter på 500 – 1,000,000 bp Innskudd inn i diverse vektorer Hybridisering Lokalisering av spesielle DNA sekvenser innen biblioteket av fragmenter PCR oppformering Direkte oppformering av et spesielt område som spenner over fra 1 bp to > 20kb DNA sekvensering Automatisert DNA sekvensering som bruker Sanger metoden, bestemmer sekvenser på opptil 600 bp på en gang Dataassistert verktøy Programmer for å identifisere sammentreff mellom en spesiell sekvens og en stor populasjon av tidligere sekvenserte fragmenter Programmer for å identifisere overlapp av DNA fragmenter Programmer fro å estimere feilmargin Programmer for å identifisere gener i kromosomale sekvenser

8 Lage storskala koblingskart
Typer av DNA polymorfismer brukt til storskala kartlegging Single nukleotide polymorfismer (SNPs) – 1/500 – 1/1000 bp gjennom genomet Enkle (Simple) sekvens repetisjoner (SSRs) – 1/20-1/40 kb gjennom genomet 2-5 nukleotides blir repetert 4-50 eller flere ganger De fleste SNP'er og SSR'er har liten eller ingen effekt på organismen Fungerer som DNA markører gjennom kromosomene Må være i stand til å raskt identifisere og analysere populasjoner fra 100vis til 1000vis av individer Figure 10.3 Fig. 10.3

9 Genetiske markører identifiserer hele genomer
De første genetiske kart brukte SSR'er som er høyt polymorfe Identifisert ved screening av DNA biblioteker med SSR prober Oppformert ved PCR og lengde- forskjeller analysert SNP'er – millioner flere i det siste identifisert ved sammenligning av ortologe områder av cDNA kloner fra ulike individer

10 Homologer – gener med tilstrekkelig sekvenslikhet til å være beslektet til en viss grad i evolusjonshistorien Ortologer – gener i to forskjellige arter som oppsto fra det samme genet i de to artenes felles stamfar Paraloger – oppsto ved duplisering innen sammen art Ortologe gener er alltid homologe, men homologe gener er ikke alltid ortologe

11 SNP’er og SSR’er ved genom dekning
Inntil nylig ble kart konstruert fra omkring 500 SSR’er jevnt spredd tvers gjennom genomet (1 SSR for hver 6 Mb) SNP’er gir mer enn 500,000 DNA markører tvers gjennom genomet

12 Typing av genetiske markører over hele Genomet
To – trinns analyse for enkle sekvens repetisjoner PCR oppformering Størrelses separasjon Figure 10.4 Fig. 10.4

13 Langtrekkende fysiske kart: karyotyper og genomiske bibliotek posisjonerer markører på kromosomene
Overlappende DNA fragmenter ordnet og orientert over hele spennet av kromosomene Basert på direkte analyse av DNA istedet for rekombinasjon som koblingskart er basert på Kartlegger virkelig antall bp, kb, eller Mb som skiller et lokus fra sine naboer Koblings- kontra fysiske kart 1 cM = 1 Mb i mennesker 1 cM = 2 Mb i mus

14 Vektorer brukt til å klone store inskudd til fysisk kartlegging
YAC’er (yeast artificial chromosomes) Innskudd størrelse 100-1,000,000 Mb BAC’er (bacterial artificial chromosomes) Innskudd størrelse 50 – 300 kb Mer stabile og lettere å rense fra verts DNA enn YAC’er

15 Hvordan bestemme rekkefølgen av kloner gjennom genomet
Overlappende innskudd hjelper til med å sette sammen klonede fragmenter Ovenfra og ned tilnærming– innskudd blir hybridisert mot karyotype av hele genomet Nedenfra og opp tilnærming – overlappende sekvenser av titusenvis av kloner bestemmes ved restriksjonsseteanalyse eller sekvens- merkede (tag) seter (STS’er)

16 Human Karyotype (a) Fullstendig sett med humane kromosomer farget med Giemsa fargestoff viser bånd (b) Ideogrammer viser idealiserte båndmønstre Figure 10.5 a Fig a

17 Kromosom 7 ved tre oppløsningsnivåer
Figure 10.5 b Fig b

18 FISH protokoll for ovenfra og ned tilnærming
Figure 10.6

19 DNA hybridisering og restriksjonskartlegging – en nedenfra og opp tilnærming
Figure 10.7 Fig. 10.7

20 Identifisering og isolering av ett sett med overlappende fragmenter fra et bibliotek
To tilnærminger Koblingskart brukes til å utvikle fysiske kart Sett av markører mindre enn1 cM fra hverandre Bruk markører til å gjenfinne fragmenter fra biblioteker ved hybridisering Konstruer kontiger – to eller flere delvis overlappende klonede fragmenter Kromosomvandring ved å bruke ender av usammenhengende kontiger til å probe fragmenter i ukartlagte områder Fysiske kartleggingsteknikker Direkte analyse av DNA Overlappende kloner settes sammen ved restriksjonskartlegging Sekvens merkede (tagged) segmenter (STS’er)

21 Høyoppløselig koblings kartlegging til å bygge overlappende sett av genomiske kloner
Figure 10.8 Fig. 10.8

22 Fysisk kartlegging av overlappende genomiske kloner uten koblingsinformasjon
Figure 10.10 Fig

23 Fysisk kartlegging ved analyse av STS’er
Figure 10.11 Fig Hver STS representerer et unikt segment av genomet som er oppformert ved PCR.

24 Sekvenskart viser rekkefølgen av nukleotider i et klonet stykke DNA
To strategier for å sekvensere det humane genom Hierarkisk shotgun tilnærming Hel-genom shotgun tilnærming Shotgun – tilfeldig genererte overlappende innskutte fraagmenter Fragmenter fra BAC’er Fragmenter fra oppkutting av hele genomet Oppkutting av DNA ved sonikering Delvis fordøying med restriksjonsensymer

25 Hierarkisk shotgun strategi Brukt av den offentlig støttede innsats for å sekvensere det humane genom Kutt 200 kb BAC kloner i ~2 kb fragmenter Sekvenser endene 10 ganger Nødvendig med omkring 1700 plasmid innskudd per BAC og omkring 20,000 BAC’er for å dekke genomet Data fra kobling og fysiske kart brukes til å sette sammen sekvenskart av kromosomene Betydelig arbeid i å lage bibliotek av hver BAC og fysisk kartlegge BAC kloner Figure 10.12 Fig

26 Hel-genom shotgun sekvensering Brukt av det private firma Celera til å sekvensere hele det humane genom Hel-genom tilfeldig kuttet tre ganger Plasmid bibliotek konstruert med ~ 2kb innskudd Plasmid bibliotek ~10 kb innskudd BAC lbibliotek med ~ 200 kb innskudd Dataprogram setter sammen sekvenser inn i kromosomer Ingen fysisk kartkonstuering Bare et BAC bibliotek Overvinner vanskelighetene med repeterte sekvenser Figure 10.13 Fig

27 Begrensninger ved hel-genom sekvensering
Noe DNA kan ikke klones F.eks. heterokromatin Noen sekvenser omarrangeres eller opprettholder delesjoner når de klones Fremtidig stor-genom sekvensering vil bruke begge typer shotgun tilnærming

28 Sekvensering av det humane genom
Det meste av prosessen skjedde iløpet av det siste året av prosjektet Instrumentforbedringer – 3545,600 bp/dag Automatisert fabrikkmessig produksjonslinje skaffet tilstrekkelig DNA til å forsyne sekvensatorene daglig Store sekvenseringssentra med instrumenter – 103,680,000 bp/dag

29 Integrering av koblings-fysiske- og sekvenskart
Gir en kontroll av den riktige rekkefølgen av hvert kart mot de to andre SSR og SNP DNA koblingsmarkører ble raskt integrert inn i fysiske kart ved PCR analyser gjennom innsatte kloner i fysiske kart SSR, SNP (koblingskart), og STS markører (fysiske kart) har unike sekvenser på 20 bp eller mer og tar hensyn til plassering på sekvenskart

30 Forandringer i biologi, genetikk og genomiks fra den humane genomsekvens
Genetikkens viktige punkter så langt Fremskynder gen-finning og gen-funksjons analyse Sekvensidentifisering i andre organismer gjennom homologi Gen funksjon i en organisme hjelper til med å forstå funksjon i en annen med hensyn på ortologe og paraloge gener Gener koder ofte for ett eller flere protein domener Tillater gjetning på funksjon av nye proteiner ved sammenligning av protein sekvenser i databaser over alle kjente domener Rask tilgang til identifisering av kjente humane polymorfismer Fremskynder kartlegging av nye organismer ved sammenligning F-eks. Mus og mennesker har høy likhet i geninnhold og rekkefølge

31 Hvordan transkripsjonsfaktor-proteindomener har utbredd seg i spesielle slekter
Figure 10.14 Fig

32 Konserverte segmenter i sammensatte blokker i humane og muse-genomer
Figure 10 10.15 Fig

33 Hovedinnsikt fra human- og modellorganismesekvenser
Omkring 40,000 humane gener Gener koder for ikke-kodende RNA eller proteiner Repeterte sekvenser utgjør > 50% av genomet Tydelige typer av genorganisering Kombinasjonsstrategier gir øket genetisk informasjon og øker mangfoldet Evolusjon ved lateral overføring av gener fra en organisme til en annen Menn har dobbelt så høy mutasjonsgrad som kvinner Humane raser har veldig få unike kjennetegnende gener Alle levende organismer stammer fra en felles stamfar

34 Gjenstående spørsmål omkring det Humane Genomet
Vanskelig å presist anslå antall gener på nåværende tidspunkt Det fullstendige genom er ikke nøyaktig sekvensert Små gener er vanskelige å identifisere Noen gener blir sjelden uttrykt og har ikke normalt kodon bruksmønster – derfor vanskelige å påvise

35 Ikke-kodende RNA gener
Transport RNA’er (tRNAs) – tilretteleggere som oversetter triplett koder fra RNA til aminosyresekvenser av proteiner Ribosomal RNA’er (rRNAs) – komponenter av ribosomet Small nucleolar RNA’er (snoRNAs) – RNA bearbeiding og basemodifisering i kjernen Small nuclear RNA’er (sncRNAs) - spleisosomer

36 Protein kodende gener danner proteomet
Proteome – kollektiv translation av 30,000 proteinkodende gener over i proteiner Kompleksiteten i proteomet øker fra gjær til mennesker Flere gener Lurere kobling, økning eller minsking av funksjoneller moduler Flere paraloger Alternativ RNA spleising – mennesker innehar betydelig mer Kjemisk modifikasjon av proteiner er høyere i mennesker

37 Repeterte sekvenser faller inn i fem klasser
Transposon-avledete repetisjoner Bearbeidede pseudogener SSRs Segmentielle duplikasjoner på kb Blokker av repeterte sekvenser ved sentromerer, telomererer og andre kromosomale særtrekk

38 Gen organisering av genomet
Gen familier Nært beslektede gener gruppert eller spredd Gen-rike områder Funksjonelle eller tilfeldige hendelser? Gen ørkener Utgjør 144 Mb eller 3% av genomet Inneholder regioner som er vanskelige å identifisere? F.eks store gener – nukleære transkripter utgjør 500 kb eller mer med veldig store introns (exons < 1% of DNA)

39 Lateral overføring av gener
> 200 humane gener kan ha oppstått ved overførsel fra organismer som bakterier Lateral overførsel er direkte overførsel fra gener fra en art til kjønnscellene til en annen

40 Dobbelt så høy mutasjonsgrad i menn
Sammenligning av X og Y kromosomer Det samme kan være tilfelle i autosomer, men vanskelig å måle Hovedmengden av humane mutasjoner skjer i menn Menn gir opphav til flere feil, men også mer mangfold

41 Menneskeraser har tilsvarende gener
Genom sekvenssentra har sekvensert betydelige deler av minst tre raser Variasjonsbredden av polymorfismer innen en rase kan være mye større enn variasjonsbredden mellom to individer av forskjellig rase Veldig få gener er rasespesifikke Genetisk er mennesker en enkelt rase

42 Alle levende organismer er en enkelt rase
Alle levende organismer har bemerkelses- verdige like genkomponenter Livet oppstod en gang og vi er etterkommere av den hendelsen Analyse av passende biologiske systemer i modellorganismer gir grunnleggende innsikt i de tilsvarende humane systemer

43 Høyeffektive instrumenter DNA sekvensator
Figure 10.23 Fig

44 Høyeffektive instrumenter eks, mikromatriser (arrays)
Figure 10.24 Fig

45 Tofarget DNA mikromatrise
To separate cDNA prøver, en fra normalgjær , og en fra mutantgjær merket med rød og grønn fluorescerende farge og hybridisert til PCR mikromatriser Figure 10.25 Fig

46 Massespektrometer Figure 10.27 Fig

47 Sosiale, etiske, og rettslige spørsmål
Privatisering av genetisk informasjon Begrensninger ved genetisk testing Patentering av DNA sekvenses Samfunnets syn på eldre mennesker Opplæring av leger Human genetisk ingeniørkunst Somatisk gen terapi – innsetting av erstatningsgener Kjønnscelle terapi – modifikasjon på de humane kjønnsceller