Presentasjon lastes. Vennligst vent

Presentasjon lastes. Vennligst vent

Høgskolen i Oslo Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet Gjennom genetisk og molekylær analyse.

Liknende presentasjoner


Presentasjon om: "Høgskolen i Oslo Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet Gjennom genetisk og molekylær analyse."— Utskrift av presentasjonen:

1 Høgskolen i Oslo Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet Gjennom genetisk og molekylær analyse

2 Oversikt over kap.10 l Utfordringer og strategier ved genomanalyse –Genomstørrelse –Egenskaper må også analyseres –Problemer med DNA polymorfismer –Utvikling av hel-genom kart l Innsikt kommer fra fullstendig genomsekvensering –Antall og type gener –Grad av repeterte sekvenser –Genom organisering og struktur –Evolusjon og lateral genoverføring l Høyeffektive verktøy for å analysere genomer og deres proteinprodukter –DNA sekvensatorer –DNA arrays (mikromatriser) –Massespektrofotometere

3 Genomene til levende organismer varierer enormt i størrelse

4 Genomikere ser på to hovedtrekk ved genomer: sekvens og polymorfisme l Hovedutfordring å bestemme sekvensen til hvert kromosom i genomet og identifisere mange polymorfismer –Hvordan kan man sekvensere et 500 Mb kromosom med 600 bp på en gang? –Hvor nøyaktig skal en genomsekvens være? »DNA sekvenseringsfeil er på omkring 1% per 600 bp –Hvordan kan en skille sekvensfeil fra polymorfismer? »Forekomst av polymorfismer i diploide humane genomer er omkring 1 av 500 bp –Gjentatte sekvenser kan være vanskelige å plassere –Uklonbart DNA kan ikke sekvenseres »Opp til 30% av genomet er heterokromatisk DNA som ikke kan klones

5 Splitt og overvinn strategien imøtekommer de fleste utfordringer l Kromosomer blir brutt ned i små overlappende biter og klonet l Endene til klonene blir sekvensert og satt sammen til de opprinnelige kromosomtrådene l Hvert stykke blir sekvensert mange ganger for å redusere feilmarginen –10-gangers sekvensdekning gir en feilmargin på mindre enn1/10 000

6 Fig. 10.2

7 Teknikker for kartlegging og kloning l Kloning –Bibliotek med DNA fragmenter på 500 – 1,000,000 bp –Innskudd inn i diverse vektorer l Hybridisering –Lokalisering av spesielle DNA sekvenser innen biblioteket av fragmenter –PCR oppformering –Direkte oppformering av et spesielt område som spenner over fra 1 bp to > 20kb l DNA sekvensering –Automatisert DNA sekvensering som bruker Sanger metoden, bestemmer sekvenser på opptil 600 bp på en gang l Dataassistert verktøy –Programmer for å identifisere sammentreff mellom en spesiell sekvens og en stor populasjon av tidligere sekvenserte fragmenter –Programmer for å identifisere overlapp av DNA fragmenter –Programmer fro å estimere feilmargin –Programmer for å identifisere gener i kromosomale sekvenser

8 Lage storskala koblingskart l Typer av DNA polymorfismer brukt til storskala kartlegging –Single nukleotide polymorfismer (SNPs) – 1/500 – 1/1000 bp gjennom genomet –Enkle (Simple) sekvens repetisjoner (SSRs) – 1/20-1/40 kb gjennom genomet –2-5 nukleotides blir repetert 4-50 eller flere ganger l De fleste SNP'er og SSR'er har liten eller ingen effekt på organismen l Fungerer som DNA markører gjennom kromosomene l Må være i stand til å raskt identifisere og analysere populasjoner fra 100vis til 1000vis av individer Fig. 10.3

9 Genetiske markører identifiserer hele genomer l De første genetiske kart brukte SSR'er som er høyt polymorfe l Identifisert ved screening av DNA biblioteker med SSR prober l Oppformert ved PCR og lengde- forskjeller analysert l SNP'er – millioner flere i det siste identifisert ved sammenligning av ortologe områder av cDNA kloner fra ulike individer

10 l Homologer – gener med tilstrekkelig sekvenslikhet til å være beslektet til en viss grad i evolusjonshistorien l Ortologer – gener i to forskjellige arter som oppsto fra det samme genet i de to artenes felles stamfar l Paraloger – oppsto ved duplisering innen sammen art l Ortologe gener er alltid homologe, men homologe gener er ikke alltid ortologe

11 SNP’er og SSR’er ved genom dekning l Inntil nylig ble kart konstruert fra omkring 500 SSR’er jevnt spredd tvers gjennom genomet (1 SSR for hver 6 Mb) l SNP’er gir mer enn 500,000 DNA markører tvers gjennom genomet

12 Typing av genetiske markører over hele Genomet l To – trinns analyse for enkle sekvens repetisjoner –PCR oppformering –Størrelses separasjon Fig. 10.4

13 Langtrekkende fysiske kart: karyotyper og genomiske bibliotek posisjonerer markører på kromosomene l Fysiske kart –Overlappende DNA fragmenter ordnet og orientert over hele spennet av kromosomene –Basert på direkte analyse av DNA istedet for rekombinasjon som koblingskart er basert på –Kartlegger virkelig antall bp, kb, eller Mb som skiller et lokus fra sine naboer –Koblings- kontra fysiske kart »1 cM = 1 Mb i mennesker »1 cM = 2 Mb i mus

14 Vektorer brukt til å klone store inskudd til fysisk kartlegging l YAC’er (yeast artificial chromosomes) –Innskudd størrelse 100-1,000,000 Mb l BAC’er (bacterial artificial chromosomes) –Innskudd størrelse 50 – 300 kb –Mer stabile og lettere å rense fra verts DNA enn YAC’er

15 Hvordan bestemme rekkefølgen av kloner gjennom genomet l Overlappende innskudd hjelper til med å sette sammen klonede fragmenter –Ovenfra og ned tilnærming– innskudd blir hybridisert mot karyotype av hele genomet –Nedenfra og opp tilnærming – overlappende sekvenser av titusenvis av kloner bestemmes ved restriksjonsseteanalyse eller sekvens- merkede (tag) seter (STS’er)

16 Human Karyotype l (a) Fullstendig sett med humane kromosomer farget med Giemsa fargestoff viser bånd l (b) Ideogrammer viser idealiserte båndmønstre Fig a

17 Kromosom 7 ved tre oppløsningsnivåer Fig b

18 FISH protokoll for ovenfra og ned tilnærming

19 DNA hybridisering og restriksjonskartlegging – en nedenfra og opp tilnærming Fig. 10.7

20 Identifisering og isolering av ett sett med overlappende fragmenter fra et bibliotek l To tilnærminger –Koblingskart brukes til å utvikle fysiske kart »Sett av markører mindre enn1 cM fra hverandre »Bruk markører til å gjenfinne fragmenter fra biblioteker ved hybridisering »Konstruer kontiger – to eller flere delvis overlappende klonede fragmenter »Kromosomvandring ved å bruke ender av usammenhengende kontiger til å probe fragmenter i ukartlagte områder –Fysiske kartleggingsteknikker »Direkte analyse av DNA »Overlappende kloner settes sammen ved restriksjonskartlegging »Sekvens merkede (tagged) segmenter (STS’er)

21 Høyoppløselig koblings kartlegging til å bygge overlappende sett av genomiske kloner Fig. 10.8

22 Fysisk kartlegging av overlappende genomiske kloner uten koblingsinformasjon Fig

23 Fysisk kartlegging ved analyse av STS’er Hver STS representerer et unikt segment av genomet som er oppformert ved PCR. Fig

24 Sekvenskart viser rekkefølgen av nukleotider i et klonet stykke DNA l To strategier for å sekvensere det humane genom –Hierarkisk shotgun tilnærming –Hel-genom shotgun tilnærming l Shotgun – tilfeldig genererte overlappende innskutte fraagmenter –Fragmenter fra BAC’er –Fragmenter fra oppkutting av hele genomet »Oppkutting av DNA ved sonikering »Delvis fordøying med restriksjonsensymer

25 Hierarkisk shotgun strategi Brukt av den offentlig støttede innsats for å sekvensere det humane genom l Kutt 200 kb BAC kloner i ~2 kb fragmenter l Sekvenser endene 10 ganger l Nødvendig med omkring 1700 plasmid innskudd per BAC og omkring 20,000 BAC’er for å dekke genomet l Data fra kobling og fysiske kart brukes til å sette sammen sekvenskart av kromosomene l Betydelig arbeid i å lage bibliotek av hver BAC og fysisk kartlegge BAC kloner Fig

26 Hel-genom shotgun sekvensering Brukt av det private firma Celera til å sekvensere hele det humane genom l Hel-genom tilfeldig kuttet tre ganger –Plasmid bibliotek konstruert med ~ 2kb innskudd –Plasmid bibliotek ~10 kb innskudd –BAC lbibliotek med ~ 200 kb innskudd l Dataprogram setter sammen sekvenser inn i kromosomer l Ingen fysisk kartkonstuering l Bare et BAC bibliotek l Overvinner vanskelighetene med repeterte sekvenser Fig

27 Begrensninger ved hel-genom sekvensering l Noe DNA kan ikke klones –F.eks. heterokromatin l Noen sekvenser omarrangeres eller opprettholder delesjoner når de klones l Fremtidig stor-genom sekvensering vil bruke begge typer shotgun tilnærming

28 Sekvensering av det humane genom l Det meste av prosessen skjedde iløpet av det siste året av prosjektet l Instrumentforbedringer – 3545,600 bp/dag –Automatisert fabrikkmessig produksjonslinje skaffet tilstrekkelig DNA til å forsyne sekvensatorene daglig –Store sekvenseringssentra med instrumenter – 103,680,000 bp/dag

29 Integrering av koblings-fysiske- og sekvenskart l Gir en kontroll av den riktige rekkefølgen av hvert kart mot de to andre l SSR og SNP DNA koblingsmarkører ble raskt integrert inn i fysiske kart ved PCR analyser gjennom innsatte kloner i fysiske kart l SSR, SNP (koblingskart), og STS markører (fysiske kart) har unike sekvenser på 20 bp eller mer og tar hensyn til plassering på sekvenskart

30 Forandringer i biologi, genetikk og genomiks fra den humane genomsekvens l Genetikkens viktige punkter så langt l Fremskynder gen-finning og gen-funksjons analyse –Sekvensidentifisering i andre organismer gjennom homologi –Gen funksjon i en organisme hjelper til med å forstå funksjon i en annen med hensyn på ortologe og paraloge gener –Gener koder ofte for ett eller flere protein domener –Tillater gjetning på funksjon av nye proteiner ved sammenligning av protein sekvenser i databaser over alle kjente domener –Rask tilgang til identifisering av kjente humane polymorfismer –Fremskynder kartlegging av nye organismer ved sammenligning –F-eks. Mus og mennesker har høy likhet i geninnhold og rekkefølge

31 Hvordan transkripsjonsfaktor-proteindomener har utbredd seg i spesielle slekter Fig

32 Konserverte segmenter i sammensatte blokker i humane og muse- genomer Fig

33 Hovedinnsikt fra human- og modellorganismesekvenser l Omkring 40,000 humane gener l Gener koder for ikke-kodende RNA eller proteiner l Repeterte sekvenser utgjør > 50% av genomet l Tydelige typer av genorganisering l Kombinasjonsstrategier gir øket genetisk informasjon og øker mangfoldet l Evolusjon ved lateral overføring av gener fra en organisme til en annen l Menn har dobbelt så høy mutasjonsgrad som kvinner l Humane raser har veldig få unike kjennetegnende gener l Alle levende organismer stammer fra en felles stamfar

34 Gjenstående spørsmål omkring det Humane Genomet –Vanskelig å presist anslå antall gener på nåværende tidspunkt »Det fullstendige genom er ikke nøyaktig sekvensert »Små gener er vanskelige å identifisere »Noen gener blir sjelden uttrykt og har ikke normalt kodon bruksmønster – derfor vanskelige å påvise

35 Ikke-kodende RNA gener l Transport RNA’er (tRNAs) – tilretteleggere som oversetter triplett koder fra RNA til aminosyresekvenser av proteiner l Ribosomal RNA’er (rRNAs) – komponenter av ribosomet l Small nucleolar RNA’er (snoRNAs) – RNA bearbeiding og basemodifisering i kjernen l Small nuclear RNA’er (sncRNAs) - spleisosomer

36 Protein kodende gener danner proteomet l Proteome – kollektiv translation av 30,000 proteinkodende gener over i proteiner l Kompleksiteten i proteomet øker fra gjær til mennesker –Flere gener –Lurere kobling, økning eller minsking av funksjoneller moduler –Flere paraloger –Alternativ RNA spleising – mennesker innehar betydelig mer –Kjemisk modifikasjon av proteiner er høyere i mennesker

37 Repeterte sekvenser faller inn i fem klasser l Transposon-avledete repetisjoner l Bearbeidede pseudogener l SSRs l Segmentielle duplikasjoner på kb l Blokker av repeterte sekvenser ved sentromerer, telomererer og andre kromosomale særtrekk

38 Gen organisering av genomet l Gen familier –Nært beslektede gener gruppert eller spredd –Gen-rike områder –Funksjonelle eller tilfeldige hendelser? l Gen ørkener –Utgjør 144 Mb eller 3% av genomet –Inneholder regioner som er vanskelige å identifisere? »F.eks store gener – nukleære transkripter utgjør 500 kb eller mer med veldig store introns (exons < 1% of DNA)

39 Lateral overføring av gener l > 200 humane gener kan ha oppstått ved overførsel fra organismer som bakterier l Lateral overførsel er direkte overførsel fra gener fra en art til kjønnscellene til en annen

40 Dobbelt så høy mutasjonsgrad i menn l Sammenligning av X og Y kromosomer l Det samme kan være tilfelle i autosomer, men vanskelig å måle l Hovedmengden av humane mutasjoner skjer i menn l Menn gir opphav til flere feil, men også mer mangfold

41 Menneskeraser har tilsvarende gener l Genom sekvenssentra har sekvensert betydelige deler av minst tre raser l Variasjonsbredden av polymorfismer innen en rase kan være mye større enn variasjonsbredden mellom to individer av forskjellig rase l Veldig få gener er rasespesifikke l Genetisk er mennesker en enkelt rase

42 Alle levende organismer er en enkelt rase l Alle levende organismer har bemerkelses- verdige like genkomponenter l Livet oppstod en gang og vi er etterkommere av den hendelsen l Analyse av passende biologiske systemer i modellorganismer gir grunnleggende innsikt i de tilsvarende humane systemer

43 Høyeffektive instrumenter DNA sekvensator Fig

44 Høyeffektive instrumenter eks, mikromatriser (arrays) Fig

45 Tofarget DNA mikromatrise To separate cDNA prøver, en fra normalgjær, og en fra mutantgjær merket med rød og grønn fluorescerende farge og hybridisert til PCR mikromatriser Fig

46 Massespektrometer Fig

47 Sosiale, etiske, og rettslige spørsmål l Privatisering av genetisk informasjon l Begrensninger ved genetisk testing l Patentering av DNA sekvenses l Samfunnets syn på eldre mennesker l Opplæring av leger l Human genetisk ingeniørkunst –Somatisk gen terapi – innsetting av erstatningsgener –Kjønnscelle terapi – modifikasjon på de humane kjønnsceller


Laste ned ppt "Høgskolen i Oslo Kap 10. Rekonstruksjon av Genomet Gjennom genetisk og molekylær analyse."

Liknende presentasjoner


Annonser fra Google