Nukleosomet.

Presentasjon om: "Nukleosomet."— Utskrift av presentasjonen:

1 Nukleosomet

2 Forskjellige modeller for 30 nm-fibre

3 Ikke-Waston-Crick-basepar
Parring mellom adeninrester i krystallstrukturen av 9-metyladenin Hoogsteen-parring mellom adenin- og tyminrester i krystallstrukturen av 9-metyladenin/1-metyltymin Hypotetisk parring mellom cytosin- og tyminrester

4 Noen mulige basepar

5 ..og enda flere

6 IR-spektrometri i upolare løsemidler viser hydrogenbindinger

7 Modifiserte nukleosider i tRNA

8 Skjematisk oversikt over sekundærstrukturen til tRNA: kløverbladstrukturen.

9 The structure of the RNA of B. subtilis RNase P..
(a) Predicted secondary structure with specificity domain drawn in various colors and catalytic domain is black

10 The structure of the RNA of B. subtilis RNase P.
(b) The X-ray structure of the specificity domain in which its various segments are colored as in Part a.

11 Strukturen av gjær-tRNAPhe

12 Tertiær baseparring i tRNA

13 16S-rRNA-sekundærstruktur (E. coli og archae, pattedyr, mitokondrier)

14 Strukturen av et hammerhode-ribozym
Venstre: Sekundærstruktur hvor prikkede linjer representerer Watson-Crick-basepar og ikke-WC-basepar representeres med heltrukne blå linjer Midt: RNA rød-blå, DNA gul-grønn Høyre: Skjematisk diagram av ribozymet

15 Forskjellige systemer for skjematisk fremstilling av RNA-strukturer

16 1958: the central dogma DNA dirigerer replikasjon (DNA til DNA) og transkripsjon (DNA til RNA) og RNA dirigerer protein syntese (translasjon)

17 Disposisjon Hvordan foregår transkripsjon?
Proteiner og andre komponenter Prosesser og mekanismer Medikamenter Logikk - hva forventes - hva finner vi? Hvordan reguleres transkripsjon Logikk - hvilke angrepsmåter er sannsynlige? Noen eksempler på ulike strategier

18 4 etapper Binding Initiering Elongering Terminering

19 Enzymet = RNA polymerase
Oppdaget 1960 Samuel Weiss og Jerard Hurwitz RNAn + NTP + (Mg++ + templat) = RNAn+1 + PPi I bakterier - et enzym Med unntak av primase Noen fag koder for egne RNA polymeraser Polypeptid sammensetning 449 kDa a2bb´s

20 Flere eukaryote RNA pol ansvarlig for ulike RNA
RNA polymerase I rRNA - en promoter RNA polymerase II mRNA - komplekse promotere RNA polymerase III 5S RNA og tRNA - intrageniske promotere

21 Components of E. coli RNA Polymerase Holoenzyme.
Page 1221

22 RNA Polymerase Subunitsa.
Page 1232

23 3D struktur E.coli RNA pol T7 RNA polymerase

24 3D av Eukaryot RNA pol Gjær RNA polymerase (lav resolusjon)

25 Flere kanaler i yRNAPII

26 Mot høyere resolusjon

27 yRNAPII yRNAPII

28 An electron micrograph of E
An electron micrograph of E. coli RNA polymerase (RNAP) holoenzyme attached to various promoter sites on bacteriophage T7 DNA. Page 1222

29 X-Ray structure of Taq RNAP core enzyme..
Page 1224 a subunits are yellow and green, b subunit is cyan, b¢ subunit is pink, w subunit is gray

30 X-Ray structure of Taq RNAP. (b) The holoenzyme viewed as in Part a.
Page 1224

31 Model of the closed (RPc) complex of Taq RNAP with promoter-containing DNA extending between positions –60 and +25. Page 1225

32 Model of the open (Rpo) complex of Taq RNAP with promoter-containing DNA showing the transcription bubble and the active site. Page 1225

33 Templatbinding

34 Bindingens logikk - hva kan vi forvente?
Sekvensspesifikk binding Sterkere binding til promoter enn til DNA generelt Sterk binding gir effektiv RNA syntese, mens svak binding gir lavere nivåer av mRNA Kjedeseparasjon før RNA-syntese

35 Promoterbinding RNA pol danner sterke kompleks med promotere
Kd = 10-14M DNase-proteksjon -20 til +20 To konserverte områder oppstrøms -10 region (Pribnow-box) TATAAT -35 region (optimalt TTGACA) Initieringsregion: +1 alltid A (CAT) eller G (CGT) Sigma er bestemmende for spesifisitet

36 Initiering - hva er sekvens-signalet?
To konserverte regioner

37 Dannelse av åpent kompleks - separasjon av tråder
Området fra -9 til +2 åpnes Evidens DMS-footprinting 3´-OH NTP RNA

38 Initiering

39 Initieringens logikk - hva kan vi forvente?
Enzymatisk reaksjon NTP + Mg++ + templat = RNA + PPi Energi fra hvor? Retning på kobling?

40 Uventet: abortiv initiering
Initiert RNA syntese ofte abortert etter 2-9 nukleotider Oppfylling av RNA kanal - før overgang til elongeringskonformasjon

41 Medikament: Rifampicin inhiberer prokaryot transkripsjon
Streptomyces m. produkt = rifamycin B Semisyntetisk rifampicin Inhiberer spesifikt prokaryot transkripsjon via binding til b-subenhet og lager et bundet men blokkert enzym

42 Elongering

43 Elongeringens logikk - hva kan vi forvente?
Kompleks av prosessiv type som forblir værende i samme kompleks og forlenger det RNA som ble initiert Topologisk nøtt

44 Retning av polymerisering
Her vil innmerking holde seg lenge selv om hot GTP erstattes med kald Her vil innmerking raskt forsvinne når hot GTP erstattes med kald

45 Medikament: cordycepin (3-deoksyadenosin)
Blokkerer bakteriell RNA syntese Virker ved inkorporering og kjedeterminering

46 Topologisk konsekvens av polymerisering
Hva er mest hensiktsmessig å snurre? RNA polymerasen - NEI DNA templaten - JA

47 Transkripsjon leder til supercoiling
Når uparet transkripsjonsboble beveger seg, dannes Foran: positiv supercoiling (tettere tvunnet) Plasmid blir positivt supercoilet i gyrasemutant Bak: negativ supercoiling (undertvunnet) Plasmid blir negativt supercoilet i topo I-mutant

48 Hvor rask skjer elongering? Hvor mye feil?
In vivo: nt per sek Initiering opp til 1x per sek Fidelitet: feilinkorporering 1: 104

49 Medikament: det interkalerende middel Actinomycin D
Binder sterkt via interkalering og blokkerer både transkripsjon og replikasjon Interkalering via phenoxazone ring Minor groove binding av peptid del

50 Terminering

51 Termineringens logikk - hva kan vi forvente?
Respons på et sekvenssignal Hva er signalet? Overgang fra sterkt elongeringskompleks til ustabilt termineringskompleks - hvordan skjer dette?

52 Signalet = GC-rik palindrom + U-strekk
To-delt signal 4-10 A-T med Aene i templat Palindrom GC-rik region like foran Denne danner ”hairpin”

53 Modell Hairpin gir RNA pol pause og induserer konformasjonsendring i enzymet RNA henger nå bare svakt i templat via dA-rU og dissosierer Forutsagt effekt av GTP til ITP (svekket terminering) Flere andre forhold bidrar Kontekst, NTP, supercoil osv

54 Assistert terminering - rho-avhengig
Noen termineringsseter krever en hjelpefaktor (rho-faktor) Rho = Hexamer NTPase som katalyserer opptvinning (unwinding) Modell Rho binder RNA oppstrøms via et spesifikt motiv, migrerer mot polymerasen, opptvinning, frigjøring av transkript

55 Rho factor. Page 1231 The Rho protomer with its N-terminal domain cyan, its C-terminal domain red, and their connecting linker yellow.

56 Rho factor. Page 1231 The Rho hexamer. Its six subunits, each of which are drawn in a different color, form an open lock washer-shaped hexagonal ring.

57 Rho factor Page 1231 The solvent-accessible surface of the Rho hexamer as viewed from the top of Part b.

58 Hvordan regulere transkripsjon?
Behov for regulering: Nivå: Noen mRNA trenges i store mengder, andre i små Timing: Forskjellige mRNA trenges til ulike tidspunkt Respons: Noen mRNA trenges bare i visse miljø (nærvær av ulike næringsstoffer) Hvordan oppnås ulike transkripsjonsnivå?

59 Rask endring i prokaryoter
Koblet translasjon /transkripsjon gir respons innen minutter Translasjon av mRNA før transkripsjon er ferdig mRNAs levetid også kort (1-3min)

60 Enkel regulering av NIVÅ via ulike optimale promotere
lacI genet er lavt uttrykt pga svak promoter (avvik fra consensus) <10 mlk pr celle Svak Svak 10000 mlk pr celle Sterk Sterk

61 Regulering av TIMING - serie av sigma-faktorer
Utvikling/differensiering = tidsmessig ordnet ekspresjon av gen-programmer Fag-infeksjon - enkel modell for slik timing Early - middle - late genes B.subtilis infisert av fagen SP01 Early genes - via vertens RNAP/s - normale promotere Et tidlig produkt = sgp28 en ny s med endret promoterpreferanse Middle genes - via vertens RNAP/sgp28 - egne promotere Late genes - via vertens RNAP/sgp33/34 - egne promotere

62 Regulering av RESPONS - via repressorer (og aktivatorer)
Prokaryot transkripsjons-regulering via tre elementer: Promotere gjenkjennes av RNA polymerasen Operatorer gjenkjennes av repressorer Positive kontrollelementer gjenkjennes av aktivatorer

63 Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter
Aktiviteten av en promoter in vivo i fravær av regulatoriske sekvenser og aktivatorer/repressorer Prokaryoter: grunntilstand = åpen Ingen begrensning på RNA polymerasens tilgang til promotere Repressorer blokkerer tilgang Aktivatorer kun nødvendige på visse svake promotere Eukaryoter: grunntilstand = lukket (pga kromatin) En sterk core-promoter alene er inaktiv i eukaryoter De fleste eukaryote gener krever aktivatorer

64 Logikk: ”Grunntilstand” ulik i pro- versus eukaryoter
Prokaryoter Eukaryoter

65 Eksempel på repressorregulering av promotertilgang
Lac operon Eksempel på repressorregulering av promotertilgang

66 Induksjon- tilpasning til næring
E.coli lager enzymer for laktosefermentering kun når laktose er til stede + lactose - rask induksjon av galaktosid permease ß-galaktosidase Inducer = 1,6-allolactose Lab:IPTG

67 Genetisk kartlegging Operon Strukturelle gener Operator Promoter
Proteinkodende Operator Bindingssekvens for regulator Promoter Bindingssekvens for RNA polymerase

68 Evidens for repressor Konstitutive mutasjoner – lac-operonet aktivt i fravær av inducer Mutasjon mappet til lacI genet lacI ligger utenfor operonet lacI virker i trans via kodet protein-produkt (lac repressor) Oc mutasjoner samme effekt men virker i cis (operator mutasjon)

69 Konjugasjon - evidens for at lacI virker i trans
I+Z+ I-Z- Uten inducer ß-gal syntese starter pga Z+ Represjon forsinket Pga lacI virker i trans

70 The nucleotide sequence of the E. coli lac promoter–operator region.
Page 1239

71 Systemet Uten inducer: AV Med inducer: PÅ
Lac-repressor binder operator Med inducer: PÅ Lac-repressor inaktiveres av inducer

72 Lac repressor Tetramer Hver monomer binder IPTG
Kd = 10-13M Tetramer Hver monomer binder IPTG DNA gjenkjenning via sliding Raskere enn diffusjon IPTG Kd = 10-6M

73 Mekanisme for Lac represjon
Lac operator og promoter overlapper - trolig at repressor blokkerer tilgang for RNA pol Likevel, noe mer

74 X-Ray structure of the lac repressor subunit.
Page 1248

75 X-ray structure of the lac repressor-DNA complex.
Page 1249

76 NMR structure of the lac repressor-DNA complex.
Page 1249

77 Model of the 93-bp DNA loop formed when lac repressor binds to O1 and O3.
Page 1250

78 Eksempel på aktivering av gener via CAP-cAMP komplekset
Katabolittrepresjon Eksempel på aktivering av gener via CAP-cAMP komplekset

79 Glukoses forrang Glukose foretrukket metabolitt Katabolitt represjon
nærvær av glukose hindrer uttrykk av gener nødvendige for annen fermentering (laktose, arabinose, galaktose) Hvordan senses høy/lav glukose? via cAMP! Glukose senker cAMP-nivået

80 Eksempel på katabolittrepresjon – lac-operonet
Lac-operonet ”skrus på” av laktose Lac-operonet ”skrus av” av glukose Katabolitt represjon Induksjon

81 CAP eller CRP Respons overfor cAMP skjer via CAP cAMP-bindende dimer
= Catabolite gene activator protein Kalles også CRP (cAMP receptor protein) cAMP-bindende dimer Endrer konformasjon ved binding av cAMP 90o

82 Mekanisme for aktivering?
CAP kan kontakte RNA pol direkte CAP binder oppstrøms initieringskompleks De to bindes i løsning CAP endrer DNA-konformasjonen 90o indusert bøyning - endrede relative posisjoner Major groove lukkes, minor åpnes CAPs effekt gjenskapes av DNA-sekvenser som spontant bøyes

83 To mulige mekanismer Posisjon Bøyning CAP x RNApol.

84 X-Ray structures of CAP–cAMP complexes
X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (a) CAP–cAMP in complex with a palindromic 30-bp duplex DNA. Page 1241

85 X-Ray structures of CAP–cAMP complexes
X-Ray structures of CAP–cAMP complexes. (b) CAP–cAMP in complex with a 44-bp palindromic DNA and the aCTD oriented similarly to Part a. Page 1241

86 X-Ray structures of CAP-cAMP complexes
X-Ray structures of CAP-cAMP complexes. (c) CAP dimer’s two helix-turn-helix motifs bind in successive major grooves of the DNA. Page 1241

87 Sekvens-spesifikk DNA-binding
Prinsipper og eksempler

88 Hvordan gjenkjennes sekvens fra utsiden?
Elektrostatisk interaksjon Form/ geometri Hydrogen- bindinger Hydrofob interaksjon

89 Komplementære former Dimensjonen tilheliks passer dimensjonene i major groove av B-DNA Sidegruppene peker utover og er gunstig plassert for dannelse av hydrogenbindinger

90 Gjenkjenning via hydrogenbinding
Hydrogenbinding er sentral for spesifikk gjenkjenning Hydrogenbindingspotensialet er ikke uttømt i dupleks DNA, ledige seter peker ut mot major groove D A A

91 Heliks-turn-heliks (HTH) motiv er vanlig i prokaryoter
HTH = 2 a-helikser (120o kryss) 2.heliks = gjenkjenningsheliks 434 fag repressor

92 Et lignende eksempel - Cro protein fra 434 fag

93 Indirect read-out?

94 Unntak: DNA-binding via b-ribbon
Met repressor Arc repressor

95 Arabinose-operonet

96 Stort oppstrøms kontrollområde

97 Kontroll via looping

98 X-Ray structure of E. coli AraC in complex with L-arabinose.
Page 1247

99 Eksempel på regulering via både initiering og terminering
Trp operon Eksempel på regulering via både initiering og terminering

100 nivå: repressor + corepressor
Trp repressor binder tryptofan og styrkes som repressor Logikk: når Trp tilgjengelig, reduseres syntese TrpR + Trp binder operator og inhiberer operonet 70-fold Trp = korepressor (økt represjon) ≠ inducer som svekker represjon

101 Trp repressor - indusert DNA-binding
Trp repressor binder sin operator kun i nærvær av tryptofan (rød)

102 Trp repressor

103 2. Nivå: regulering av terminering
Trp operon har en lang ledersekvens (trpL)ds Lav Trp: hele den polycistroniske mRNA produseres Høy Trp: en kort versjon lages, prematurt terminert i trpL Attenuator = kontrollelement ansvarlig for prematur terminering

104 Trp-operon

105 Mekanisme for attenuering
trpL: 4 segmenter og 2 konformasjoner med ulik effekt 1-2 i en mini-ORF med 2 Trp 3-4 er en klassisk terminator

106 Modell Mye Trp: ribosomet starter straks translasjon og fremmer konformasjonen som gir terminering Lite Trp: ribosomets venting på Trp-tRNA fremmer 2-3 konformasjon som tillater videre transkripsjon

107 Samspill mellom ribosomet og Trp-tRNA

108 Amino Acid Sequences of Some Leader Peptides in Operons Subject to Attentuation.
Page 1253

109 Eksempel på regulering via signalmolekyl som speiler vekstforhold
Stringent respons Eksempel på regulering via signalmolekyl som speiler vekstforhold

110 ppGpp Stringent respons: ved aminosyremangel skjer en metabolsk tilpasning hvor rRNA- og tRNA-syntesen reduseres fold Ved stringent respons akkumuleres ppGpp Syntese: relA ATP + GTP = AMP + ppGpp Degradering: spoT

111 The posttranscriptional processing of E. coli rRNA.

112 The proposed stem-and-giant-loop secondary structure in the 23S region of the E. coli primary rRNA transcript..