Tre temaer 1. Protein ekspresjon 2. DNA-Bindingsassay: EMSA

Presentasjon om: "Tre temaer 1. Protein ekspresjon 2. DNA-Bindingsassay: EMSA"— Utskrift av presentasjonen:

1 Tre temaer 1. Protein ekspresjon 2. DNA-Bindingsassay: EMSA
Litt generelt om ekspresjon T7-systemet for ekspresjon i E.coli cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3) Rensing via ionebytterkromatografi 2. DNA-Bindingsassay: EMSA Bindingsreaksjon, kompleksdannelse Elektroforetisk separasjon 3. Radioaktiv merking av oligonukleotid Oligonukleotid m/ 5´-OH Polynukleotid kinase (PNK) g-[32P]-ATP

2 Ukens program SDS-PAGE EMSA MANDAG TIRSDAG ONSDAG Plasmid konstruksjon
Kultur med E.coli induseres til protein produkasjon E.coli høstes, lyseres og ultrasentrifugat preppes I ventetiden: Merking av DNA-probe til EMSA Pakking av kolonne til protein rensing Støpe PA-geler (SDS-PAGE og EMSA) TIRSDAG Rensing av protein på S-Sepharose SDS-PAGE over natt EMSA med autoradiogram over natt ONSDAG Farge geler, fremkalle film, Vurdere resultat cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

3 Noen generelle prinsipper
cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

4 Ekspresjon og rensing - mange trinn å optimalisere
cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon Protein rensing E.coli Ekspresjon +antibiotika

5 Valg av vert for proteinekspresjon
Mengde Modifikasjon E. coli Rask vekst, høy produksjon Fravær av euk.modifikasjoner Gjær Rimelig rask vekst Noen modifikasjoner Animalske celler i kultur Langsom, kostbar vekst Relevante modifikasjoner Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli +antibiotika Ekspresjon Protein rensing

6 Ekspresjonsvektorer - grunnleggende oppbygning
E.coli ori AmpR Ekspresjonsvektorer - grunnleggende oppbygning MCS Plasmider som inneholder elementer som dirigerer ekspresjon av innsatt cDNA Promoter Effektiv + Regulerbar Terminator MCS - multi cloning site Seleksjonsmarkør ApR - ampicillin resistens markør Koder for ß-lactamase som gir resistens overfor ampicillin. Ampicillin inhiberer peptidoglycansyntese slik at cellevegg ikke dannes. Ødelegger derfor bare voksende celler. CmR - chloramphenicol resistens markør Kloramfenikol inhiberer protein syntesen. Resistensgenet (CAT) koder for enzymet ”chloramphenicol acetyl transferase” som inaktiverer kloramfenikolet. AmpR CmR E.coli +antibiotika

7 cDNA innskudd Det som dirigerer protein syntesen E.coli ori AmpR
MCS Det som dirigerer protein syntesen AmpR CmR E.coli +antibiotika

8 Hva genteknologien har tilført protein biokjemien?
1. Protein ekspresjon forenklet Kilde: ikke lenger begrenset til naturlige. Når cDNA er tilgjengelig, kan tilhørende protein produseres i store mengder i en rekke verter Laboppgave: normal kilde = stamceller i benmarg, recombinant kilde = E.coli 2. Enkel generering av mutanter Punktmutasjoner etter ønske Studie av subdomener Tillegg av ”tags” som forenkler påvisning eller rensing

9 Fordeler ved in vitro mutagenese
Punktmutasjoner - mutagenese via PCR Eks.: Blir serin 116 fosforylert? Ved mutagenese lages en mutant S116A (ikke fosforylerbar uten OH-gruppe) som testes. Hvis villtypen men ikke mutanten fosforyleres, kan spørsmålet besvares positivt. Ekspresjon av subdomener Jfr PCR-forelesning Laboppgave: R2R3 svarende til aa i c-Myb Påsetting av ”tags” som letter rensing Tags er små tilleggssekvenser som gir proteinet evne til å bindes spesifikt til visse kolonner His6-tags gir binding til immobilisert Ni2+-kolonner GST-tags gir binding til glutathion kolonner Epitoper (HA, FLAG) binder immobilisert antistoff Protein X Protein Y Protein Z

10 Fordelen med tags - rensing og påvisning
cDNA * * * * Plasmid konstruksjon AmpR Immunfarging via tag Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing i et trinn Via tag-binding til kolonne +antibiotika

11 Ekspresjon og rensing - mange trinn å optimalisere
Kodon-bruk • Flere kodon-muligheter pr aa • Human pref ≠ E.coli, kan hemme translasjon cDNA Plasmid konstruksjon Signal for translasjon • RBS - AGGAGG 9±3 foran AUG • AUG - AUG > GUG,UUG,AUU,AUA • Stop kodon - UAA best AmpR Transformasjon Protein rensing E.coli Ekspresjon +antibiotika

12 c-Myb proteinet SDS-PAGE EMSA Plasmid konstruksjon Transformasjon
cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

13 SDS-PAGE EMSA Plasmid konstruksjon Transformasjon Ekspresjon
cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

14 T7 systemet SDS-PAGE EMSA Plasmid konstruksjon Transformasjon
cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

15 T7 systemet

16 T7 systemet for ekspresjon
Kaskade effekt Et gen, mange transkript Et transkript, mange translaterte protein Høyt nivå av mRNA for cDNA LysS koder for lysozym med to funksjoner Inhibitor av T7 RNA polymerase (holder basalnivå nede) Letter lysis ved å fordøye cellevegg

17 Praktiske sider ved laboppgaven
cDNA Plasmid konstruksjon AmpR Transformasjon E.coli Ekspresjon Protein rensing SDS-PAGE EMSA +antibiotika

18 Dyrking og induksjon Celle- tetthet Renhet: SDS-PAGE
+IPTG Høsting Syntese av protein Renhet: SDS-PAGE DNA-bindende aktivitet: EMSA

19 Protein ekspresjon - ekstraksjon fra celler
Mekanisk Sonikering (ultralyd) Presser Enzymatisk Celleveggfordøying Kjemisk detergenter +antibiotika

20 Lysis av E.coli Triton X-100: permeabilisering av plasmamembranen
Myb lysozym Triton X-100: permeabilisering av plasmamembranen Lysozym lekker ut og angriper celleveggen Lysat dannes Ultrasentrifugering gir ”cellefritt ekstrakt” Peptidoglycan cellevegg Cellefritt ekstrakt

21 Løselighet av rekombinant protein
Syntese To konkurrerende prosesser: Folding til løselig protein Aggregering til uløselig protein (”inclusion bodies”) Temperatur-avhengig balanse Hvis mye er uløselig, kan utbyttet av løselig protein forbedres ved å senke dyrkingstemperatur Test av løselighet Uttak fra kultur - cellepellet kokt i SDS = totalt protein Lysat - ultrasentrifugering - supernatant = løselig protein Folding Løselig Aggregering Uløselig 37oC Løselig Uløselig 25oC Løselig Uløselig

22 Protein rensing - laboppgave: ionebytter
Separasjon av proteiner på grunnlag av ulike antall ladninger tilgjengelig for interaksjon med kolonnematerialet pH bestemmer ladning på kolonne og protein Ionestyrke bestemmer likevekt/affinitet, varieres ved gradient-eluering +antibiotika Protein rensing

23 Kromatogram A280 Salt- gradient Renhet: SDS-PAGE
Indusert c-Myb protein Proteiner som Ikke binder ionebytter Salt- gradient Renhet: SDS-PAGE DNA-bindende aktivitet: EMSA

24 Analyse ved SDS-PAGE Induksjon OK - størrelse - intensitet
-IPTG +IPTG ultra Toppfraksjoner Induksjon OK - størrelse - intensitet Indusert prot = løselig Effektiv rensing

25 Tre temaer: protein ekspresjon
T7-systemet for ekspresjon i E.coli cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3) Rensing via ionebytterkromatografi 2. DNA-Bindingsassay: EMSA Bindingsreaksjon, kompleksdannelse Elektroforetisk separasjon 3. Radioaktiv merking av oligonukleotid Oligonukleotid m/ 5´-OH Polynukleotid kinase (PNK) g-[32P]-ATP

26 EMSA: electrophoretic mobility shift assay
- prot +prot Grunnprinsipp: Kompleks av protein+DNA har redusert mobilitet i nativ PA-gel relativt til DNA-probe Mobilitet bestemmes av Størrelse - proteinbinding øker størrelsen Ladning - probens ladning reduseres ved binding av basisk protein Form - kan påvise konformasjonsendring i DNA DNA-probe Duplex på bp radioaktivt merket Spesifikk sekvens gjenkjent av protein Samme assay til en rekke ulike DNA-bindende protein ved å bytte sekvens

27 EMSA: enkel assay med mange bruksområder
- prot +prot Enkelt assay-system for DNA-binding Følge rensing Påvise spesifikk DNA-bindende faktor i celleekstrakt Analytisk bruk Teste mutanter i protein eller DNA Bestemmelse av bindingskonstanter Bestemmelse av kinetiske konstanter Kan påvise indusert konformasjonsendring i DNA Syntetisk bruk Preparativ isolering av ukjent faktor

28 EMSA: trinn i praktisk oppsett
- prot +prot Lage DNA-probe radioaktivt merket Støpe PA-gel Ikke-denaturerende gel Bindingsreaksjon Optimale betingelse for kompleksdannelse Elektroforese Autoradiografi

29 Tre temaer: protein ekspresjon
T7-systemet for ekspresjon i E.coli cDNA for c-mybs DNA-bindende domene (R2R3) Rensing via ionebytterkromatografi 2. DNA-Bindingsassay: EMSA Bindingsreaksjon, kompleksdannelse Elektroforetisk separasjon 3. Radioaktiv merking av oligonukleotid Oligonukleotid m/ 5´-OH Polynukleotid kinase (PNK) g-[32P]-ATP

30 Merking av oligo i 5´-ende
PNK polynukleotid kinase O-P-O-P-O-P O H O- ATP

31 EMSA: tester for spesifisitet
Ref +spes +uspes Konkurranse (competition) Utkonkurrering med overskudd av spesifikk versus uspesifikk oligo Med kompleks med kjerneekstrakt: ulike komplekser identifiseres utfra hva de utkonkurreres med Supershift Tilsetting av antistoff mot DNA-bindende protein påvirker komplekset på en av to måter 1. Komplekset binder Ab og migrerer langsommere (=supershift) 2. Kompleksdannelse inhiberes fordi Ab blokkerer DNA-bindende domene: bortfall av kompleks Ref +Ab +IgG

32 EMSA: konkurranse-test for spesifisitet
Ref +spes +uspes Uspesifikk oligo Spesifikk oligo

33 EMSA: spesifisitetstest viktig ved analyse av ekstrakter
Ref +stimuli Faktor X? EMSA i komplekse blandinger EMSA kan brukes til å påvise tilstedeværelse av ulike DNA-bindende faktorer i celleekstrakter Vanlig med komplekst mønster av kompleksbånd - hvilke tilhører hvilken faktor? Utkonkurrering med overskudd av spesifikk oligo benyttes til å identifisere ulike komplekser Supershift Alternativ analyse med antistoff mot DNA-bindende protein: kan gi supershift eller bortfall av kompleks Faktor Y? Ref +X-oligo +Y-oligo Ref +anti-X +anti-Y

34 EMSA: 2 labforsøk Assay for tilstedeværelse av c-Myb
Råex Fraksjoner Assay for tilstedeværelse av c-Myb Konklusjon: c-Myb aktivitet tilstede i cellefritt ekstrakt og i toppfraksjon Konkurranse (competition) Utkonkurrering med overskudd av spesifikk versus uspesifikk oligo Konklusjon: indusert c-Myb R2R3 protein binder oligonukleotidet spesifikt Ref +spes +uspes

35 Radioisotoper brukt i biokjemisk arbeid
Av ulike isotoper er noen ustabile radioisotoper som avgir stråling To typer aktuelle i biokjemisk arbeid: b- og g-stråling b- stråling: Neutron proton b- + antineutrino Atomnr øker +1 (C N, P S) b- partikler lette å detektere Random prosess energispektrum g stråling: tunge radioisotoper (125I) Multistep decay som gir høyenergi-fotoner 12C 13C 14C stabile ß- partikkel 14N

36 Radioaktivitet - enheter og måling
Radioaktiv stråling måles i Ci eller Bq Ci (Curie) = desintegrasjoner fra 1 g radium = 2.2 x1012 dpm Praktisk omregning: 1 µCi = 2.22 x 106 dpm SI enhet = Becquerel (Bq) = 1 dps Praktisk omregning: 1 µCi = 3.7 x 104 Bq Måling skjer i scintillasjonsteller b- stråling scintillasjonstelling i løsning hvor stråling omdannes til lys Løsningen (”tellevæske”) inneholder fluoroforer For 32P kan man bruke vann (Cerenkov telling) Max 40% effektivitet g stråling scintillasjonstelling i fast fase hvor stråling omdannes til lys Tellereffektivitet = cpm/dpm x 100%

37 Radioaktivitet - regler for sikkerhet
Unngå å få isotoper innabords Munnpipettering forbudt, avtrekk hvis flyktige forbindelser Unngå hudkontakt Bruk alltid hansker Bruk skjermbeskyttelse mot høyenergi-stråling Vær nøye med å unngå ”søl” Bruk isotop-lab ved høye doser, sjekk alltid benk med monitor etter bruk, vask utstyr grundig etter bruk og sjekk med monitor Kast alt kontaminert avfall (løsninger og plast) i dertil egnede kontainere Ved jevnlig bruk, benytt dosimeter